La dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) describe una técnica para medir la luz dispersada por una muestra en una pluralidad de ángulos. Se utiliza para determinar tanto la masa molar absoluta como el tamaño medio de las moléculas en solución, detectando cómo dispersan la luz . La luz colimada de una fuente láser se utiliza con mayor frecuencia, en cuyo caso la técnica se puede denominar dispersión de luz láser multiangular (MALLS). La inserción de la palabra "láser" tenía por objeto tranquilizar a quienes estaban acostumbrados a realizar mediciones de dispersión de luz con fuentes de luz convencionales, como lámparas de arco de Hg, de que ahora se podían realizar mediciones de ángulo bajo. [ cita requerida ]Hasta la llegada de los láseres y sus haces finos asociados de ancho estrecho, el ancho de los haces de luz convencionales utilizados para realizar tales mediciones impedía la recopilación de datos en ángulos de dispersión más pequeños. En los últimos años, dado que todos los instrumentos comerciales de dispersión de luz utilizan fuentes láser, esta necesidad de mencionar la fuente de luz se ha eliminado y el término MALS se utiliza en todas partes.
El término "multiángulo" se refiere a la detección de luz dispersa en diferentes ángulos discretos medida, por ejemplo, por un solo detector movido sobre un rango que incluye los ángulos particulares seleccionados o una matriz de detectores fijados en ubicaciones angulares específicas. Se presenta una discusión del fenómeno físico relacionado con esta dispersión de luz estática , incluidas algunas aplicaciones, métodos de análisis de datos y representaciones gráficas asociadas con la misma.
Fondo
La medición de la luz dispersa de una muestra iluminada forma la base de la denominada medición clásica de la dispersión de la luz . Históricamente, tales mediciones se realizaban utilizando un solo detector [1] [2] girado en un arco alrededor de la muestra iluminada. El primer instrumento comercial (llamado formalmente "fotómetro disperso") fue el fotómetro de dispersión de luz Brice-Phoenix introducido a mediados de la década de 1950 y seguido por el fotómetro Sofica introducido a finales de la década de 1960.
Las mediciones se expresaron generalmente como intensidades dispersas o irradiancia dispersa. Dado que la recopilación de datos se realizó cuando el detector se colocó en diferentes ubicaciones en el arco, cada posición correspondiente a un ángulo de dispersión diferente, el concepto de colocar un detector separado en cada ubicación angular de interés [3] fue bien entendido, aunque no implementado comercialmente [4] hasta finales de la década de 1970. Múltiples detectores que tienen diferente eficiencia cuántica tienen una respuesta diferente y, por lo tanto, deben normalizarse en este esquema. Un interesante sistema basado en el uso de película de alta velocidad fue desarrollado por Brunsting y Mullaney [5] en 1974. Permitió registrar todo el rango de intensidades dispersas en la película con un escaneo densitómetro posterior que proporcionaba las intensidades dispersas relativas. El uso convencional en ese momento de un solo detector girado alrededor de una muestra iluminada con intensidades recolectadas en ángulos específicos se denominó dispersión de luz diferencial [6] después del término de mecánica cuántica sección transversal diferencial , [7] σ (θ) expresado en mili-barns / estereorradián. Las mediciones de secciones transversales diferenciales se realizaban comúnmente, por ejemplo, para estudiar la estructura del núcleo atómico mediante la dispersión de nucleones, [8] como los neutrones . Es importante distinguir entre la dispersión de luz diferencial y la dispersión de luz dinámica , ambas denominadas con las iniciales DLS. Este último se refiere a una técnica bastante diferente, que mide la fluctuación de la luz dispersa por interferencia constructiva y destructiva, estando ligada la frecuencia al movimiento térmico, movimiento browniano de las moléculas o partículas en solución o suspensión.
Una medición MALS requiere un conjunto de elementos auxiliares. El más importante de ellos es un haz de luz colimado o enfocado (generalmente de una fuente láser que produce un haz colimado de luz monocromática) que ilumina una región de la muestra. En los instrumentos modernos, el haz generalmente está polarizado en un plano perpendicular al plano de medición, aunque se pueden usar otras polarizaciones, especialmente cuando se estudian partículas anisotrópicas. Las mediciones anteriores, antes de la introducción de los láseres, se realizaron utilizando haces de luz enfocados, aunque no polarizados, de fuentes como las lámparas de arco de Hg. [ cita requerida ] Otro elemento requerido es una celda óptica para contener la muestra que se está midiendo. Alternativamente, pueden emplearse celdas que incorporen medios para permitir la medición de muestras en movimiento. Si se van a medir las propiedades de dispersión de partículas individuales, se debe proporcionar un medio para introducir dichas partículas una por una a través del haz de luz en un punto generalmente equidistante de los detectores circundantes.
Aunque la mayoría de las mediciones basadas en MALS se realizan en un plano que contiene un conjunto de detectores generalmente colocados de manera equidistante a partir de una muestra ubicada en el centro a través de la cual pasa el haz de iluminación, también se han desarrollado versiones tridimensionales [9] [10] en las que los detectores se encuentran en la superficie de una esfera con la muestra controlada para pasar por su centro donde se cruza con la trayectoria del haz de luz incidente que pasa a lo largo de un diámetro de la esfera. El primer marco [9] se utiliza para medir partículas de aerosol, mientras que el último [10] se utiliza para examinar organismos marinos como el fitoplancton .
La medición tradicional de la dispersión de luz diferencial era prácticamente idéntica a la técnica MALS utilizada actualmente. Aunque la técnica MALS generalmente recopila datos multiplexados secuencialmente a partir de las salidas de un conjunto de detectores discretos, la medición de dispersión de luz diferencial anterior también recopiló datos secuencialmente cuando un solo detector se movió de un ángulo de recolección al siguiente. La implementación de MALS es, por supuesto, mucho más rápida, pero los mismos tipos de datos se recopilan y se interpretan de la misma manera. Por tanto, los dos términos se refieren al mismo concepto. Para mediciones de dispersión de luz diferencial, el fotómetro de dispersión de luz tiene un solo detector, mientras que el fotómetro de dispersión de luz MALS generalmente tiene una pluralidad de detectores.
Otro tipo de dispositivo MALS fue desarrollado en 1974 por Salzmann et al. [11] basado en un detector de patrones de luz inventado por George et al. [12] para Litton Systems Inc. en 1971. El detector Litton fue desarrollado para muestrear la distribución de energía luminosa en el plano focal posterior de una lente esférica para muestrear relaciones geométricas y la distribución de densidad espectral de objetos registrados en transparencias de película.
La aplicación del detector Litton de Salzman et al. proporcionó medición en 32 pequeños ángulos de dispersión entre 0 ° y 30 °, y promedió en una amplia gama de ángulos azimutales, ya que los ángulos más importantes son los ángulos de avance para la dispersión de luz estática. Para 1980, Bartholi et al. [13] había desarrollado un nuevo enfoque para medir la dispersión en ángulos de dispersión discretos mediante el uso de un reflector elíptico para permitir la medición en 30 ángulos polares en el rango de 2,5 ° ≤ θ ≤ 177,5 ° con una resolución de 2,1 °.
La comercialización de sistemas de múltiples ángulos comenzó en 1977 cuando Science Spectrum, Inc. [14] patentó un sistema capilar de flujo continuo para un sistema de bioensayo personalizado desarrollado para la USFDA . El primer instrumento comercial MALS que incorpora 8 detectores discretos fue entregado a SC Johnson and Son, por Wyatt Technology Company, en 1983, [15] seguido en 1984 con la venta del primer instrumento de flujo de 15 detectores (Dawn-F) [16] a AMOCO. En 1988, se introdujo una configuración tridimensional [9] específicamente para medir las propiedades de dispersión de partículas de aerosol individuales. Aproximadamente al mismo tiempo, se construyó el dispositivo submarino para medir las propiedades de luz dispersa de un solo fitoplancton. [10] Las señales se recogieron mediante fibras ópticas y se transmitieron a fotomultiplicadores individuales. Alrededor de diciembre de 2001, se comercializó un instrumento que mide 7 ángulos de dispersión utilizando un detector CCD (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Hotlsville, NY).
La literatura asociada con las mediciones realizadas por fotómetros MALS es extensa. [17] [18] tanto en referencia a las mediciones por lotes de partículas / moléculas como a las mediciones posteriores al fraccionamiento por medios cromatográficos, como la cromatografía de exclusión por tamaño [19] (SEC), la cromatografía de fase inversa [20] (RPC) y el fraccionamiento de flujo de campo [ 21] (FFF).
Teoría
La interpretación de las medidas de dispersión realizadas en las ubicaciones multiangulares se basa en cierto conocimiento de las propiedades a priori de las partículas o moléculas medidas. Las características de dispersión de diferentes clases de tales dispersores pueden interpretarse mejor mediante la aplicación de una teoría apropiada. Por ejemplo, las siguientes teorías se aplican con mayor frecuencia.
La dispersión de Rayleigh es la más simple y describe la dispersión elástica de luz u otra radiación electromagnética por objetos mucho más pequeños que la longitud de onda incidente. Este tipo de dispersión es responsable del color azul del cielo durante el día y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de longitud de onda.
La aproximación de Rayleigh-Gans es un medio de interpretar las mediciones de MALS con el supuesto de que las partículas dispersas tienen un índice de refracción, n 1 , muy cercano al índice de refracción del medio circundante, n 0 . Si establecemos m = n 1 / n 0 y asumimos que | m - 1 | << 1 , entonces tales partículas pueden considerarse compuestas por elementos muy pequeños, cada uno de los cuales puede representarse como una partícula de dispersión de Rayleigh. Por tanto, se supone que cada elemento pequeño de la partícula más grande se dispersa independientemente de cualquier otro.
La teoría de Lorenz-Mie [22] se utiliza para interpretar la dispersión de la luz por partículas esféricas homogéneas. La aproximación de Rayleigh-Gans y la teoría de Lorenz-Mie producen resultados idénticos para esferas homogéneas en el límite como | 1 - m | → 0 .
La teoría de Lorenz-Mie puede generalizarse a partículas esféricamente simétricas por referencia. [23] Erma ha tratado formas y estructuras más generales. [24]
Los datos de dispersión generalmente se representan en términos de la denominada relación de Rayleigh en exceso definida como la relación de Rayleigh de la solución o el evento de una sola partícula del que se resta la relación de Rayleigh del propio fluido portador y otras contribuciones de fondo, si las hubiera. La relación de Rayleigh medida en un detector que se encuentra en un ángulo θ y subtiende un ángulo sólido ΔΩ se define como la intensidad de la luz por unidad de ángulo sólido por unidad de intensidad incidente, I 0 , por unidad de volumen de dispersión iluminado ΔV . El volumen de dispersión ΔV desde el cual la luz dispersa llega al detector está determinado por el campo de visión del detector generalmente restringido por aberturas, lentes y topes. Considere ahora una medición de MALS hecha en un plano a partir de una suspensión de N partículas / moléculas idénticas por ml iluminadas por un fino haz de luz producido por un láser. Suponiendo que la luz esté polarizada perpendicular al plano de los detectores. La intensidad de la luz dispersa medida por el detector en un ángulo θ superior a la dispersada por el fluido en suspensión sería
- ,
donde i (θ) es la función de dispersión [1] de una sola partícula, k = 2πn 0 / λ 0 , n 0 es el índice de refracción del fluido en suspensión y λ 0 es la longitud de onda de vacío de la luz incidente. La relación de Rayleigh en exceso, R (θ) , viene dada por
- .
Incluso para una esfera homogénea simple de radio a cuyo índice de refracción, n, es casi el mismo que el índice de refracción "n 0 " del fluido en suspensión, es decir, la aproximación de Rayleigh-Gans, la función de dispersión en el plano de dispersión es relativamente compleja. cantidad
- , dónde
- , ,
y λ 0 es la longitud de onda de la luz incidente en el vacío.
Aplicaciones
La parcela Zimm y la colección de lotes
MALS se usa más comúnmente para la caracterización de masa y tamaño de moléculas en solución. Implementaciones tempranas de MALS como las discutidas por Bruno H. Zimm en su artículo “Aparatos y métodos para la medición e interpretación de la variación angular de la dispersión de la luz; Resultados preliminares en soluciones de poliestireno ” [1] implicó la utilización de un solo detector girado alrededor de una muestra contenida dentro de un recipiente transparente. Las mediciones MALS de muestras que no fluyen como esta se denominan comúnmente "mediciones por lotes". Mediante la creación de muestras a varias concentraciones bajas conocidas y la detección de luz dispersa alrededor de la muestra en diferentes ángulos, se puede crear un diagrama de Zimm [25] trazando: vs donde c es la concentración de la muestra yk es un factor de estiramiento usado para poner kc y en el mismo rango numérico.
Cuando se grafica, se puede extrapolar tanto al ángulo cero como a la concentración cero, y el análisis del gráfico dará el radio cuadrático medio de las moléculas de muestra desde la pendiente inicial de la línea c = 0 y la masa molar de la molécula en el punto donde ambos la concentración y el ángulo son iguales a cero. Las mejoras en la gráfica de Zimm, que incorporan todos los datos recopilados, comúnmente denominada "ajuste global", han reemplazado en gran medida la gráfica de Zimm en los análisis de lotes modernos. [26]
SEC y modo de flujo
Con el advenimiento de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), las mediciones de MALS comenzaron a usarse junto con un detector de concentración en línea para determinar la masa molar absoluta y el tamaño de las fracciones de muestra que eluyen de la columna, en lugar de depender de las técnicas de calibración. Estas mediciones de MALS en modo de flujo se han extendido a otras técnicas de separación, como el fraccionamiento de flujo de campo , la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de fase inversa .
La dependencia angular de los datos de dispersión de luz se muestra a continuación en una figura de mezcla de esferas de poliestireno que fue separada por SEC. Las dos muestras más pequeñas (más alejadas a la derecha) eluyeron en último lugar y no muestran dependencia angular. La muestra, en segundo lugar a la derecha, muestra una variación angular lineal con la intensidad aumentando en ángulos de dispersión más bajos. La muestra más grande, a la izquierda, eluye primero y muestra una variación angular no lineal.
Utilidad de las mediciones de MALS
Masa y tamaño molar
El acoplamiento de MALS con un detector de concentración en línea después de un medio de separación de muestras como SEC permite el cálculo de la masa molar de la muestra eluida además de su radio cuadrático medio. La siguiente figura representa una separación cromatográfica de agregados de BSA. Se muestran la señal de dispersión de luz de 90 ° de un detector MALS y los valores de masa molar para cada corte de elución.
Interacciones moleculares
Como MALS puede proporcionar masa molar y tamaño de moléculas, permite el estudio de la unión proteína-proteína, la oligomerización y la cinética del autoensamblaje, asociación y disociación. Comparando la masa molar de una muestra con su concentración, se puede determinar la afinidad de unión y la estequiometría de las moléculas que interactúan.
Ramificación y conformación molecular
La relación de ramificación de un polímero se relaciona con el número de unidades de ramificación en un polímero ramificado aleatoriamente y el número de brazos en polímeros ramificados en estrella y fue definida por Zimm y Stockmayer como
Dónde es el radio cuadrático medio de macromoléculas lineales y ramificadas con masas molares idénticas. [27] Al utilizar MALS junto con un detector de concentración como se describió anteriormente, se crea una gráfica log-log del radio cuadrático medio versus la masa molar. La pendiente de esta parcela produce la relación de ramificación, g. [28]
Además de la ramificación, el gráfico log-log de tamaño frente a masa molar indica la forma o conformación de una macromolécula. Un aumento en la pendiente del gráfico indica una variación en la conformación de un polímero de esférico a espiral aleatorio a lineal. Combinando el radio cuadrático medio de MALS con el radio hidrodinámico obtenido de las mediciones DLS produce el factor de forma ρ = , para cada fracción de tamaño macromolecular.
Otras aplicaciones
Otras aplicaciones de MALS incluyen el tamaño de nanopartículas , estudios de agregación de proteínas , interacciones proteína-proteína , movilidad electroforética o potencial zeta. Se han adoptado técnicas MALS para el estudio de la estabilidad y el uso de fármacos farmacéuticos en nanomedicina .
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