Amplificación de desplazamiento múltiple
La amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) es una técnica de amplificación de ADN . Este método puede amplificar rápidamente cantidades diminutas de muestras de ADN a una cantidad razonable para el análisis genómico. La reacción comienza por hibridación de cebadores hexámeros aleatorios con la plantilla: la síntesis de ADN se lleva a cabo mediante una enzima de alta fidelidad , preferentemente ADN polimerasa Φ29 . En comparación con las técnicas de amplificación por PCR convencionales , la MDA no emplea cebadores específicos de secuencia, pero amplifica todo el ADN, genera productos de mayor tamaño con una frecuencia de error más baja y funciona a una temperatura constante. La MDA se ha utilizado activamente en la amplificación del genoma completo.(WGA) y es un método prometedor para su aplicación a la secuenciación del genoma unicelular y a los estudios genéticos basados en secuenciación.
Muchos casos biológicos y forenses que involucran análisis genético requieren la secuenciación de ADN de cantidades diminutas de muestra, como ADN de células individuales sin cultivar o trazas de tejido recolectado de escenas del crimen. Los métodos de amplificación de ADN basados en la reacción en cadena de la polimerasa convencional ( PCR ) requieren cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia y polimerasa termoestable (generalmente Taq ) , y pueden usarse para generar cantidades significativas de ADN a partir de cantidades diminutas de ADN. Sin embargo, esto no es suficiente para las técnicas modernas que utilizan análisis de ADN basados en secuenciación. Por lo tanto, es necesario un método no específico de secuencia más eficaz para amplificar cantidades diminutas de ADN, especialmente en estudios genómicos unicelulares.
La ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 es una enzima de alta procesividad que puede producir amplicones de ADN de más de 70 kilopares de bases. [1] Su alta fidelidad y 3'-5' actividad correctora reduce la tasa de error de amplificación a 1 en 10 6 -10 7 bases en comparación con convencional Taq polimerasa con una tasa de error reportadas de 1 en 9.000. [2] La reacción se puede llevar a cabo en una condición isotérmica moderada de 30 ° C y por lo tanto no requiere un termociclador . Se ha utilizado activamente en la clonación libre de células, que es el método enzimático de amplificar el ADN in vitro sin cultivo celular yExtracción de ADN . El fragmento grande de la ADN polimerasa de Bst también se usa en MDA, pero generalmente se prefiere Ф29 debido a su suficiente rendimiento de producto y actividad de corrección de pruebas. [3]
Los cebadores hexámeros son secuencias compuestas por seis nucleótidos aleatorios . Para aplicaciones de MDA, estos cebadores suelen estar modificados con tiofosfato en su extremo 3 'para transmitir resistencia a la actividad exonucleasa 3'-5' de la ADN polimerasa Ф29 . Las reacciones de MDA comienzan con la hibridación de dichos cebadores con la plantilla de ADN seguida de un alargamiento de la cadena mediado por la polimerasa. A lo largo de la reacción de amplificación se produce un número creciente de eventos de hibridación de cebadores.
La reacción de amplificación se inicia cuando múltiples hexámeros de cebadores se hibridan con el molde. Cuando la síntesis de ADN avanza al siguiente sitio de inicio, la polimerasa desplaza la hebra de ADN recién producida y continúa su elongación de la hebra. El desplazamiento de la hebra genera una plantilla de ADN monocatenario recién sintetizada para que aparezcan más cebadores. La hibridación adicional del cebador y el desplazamiento de la hebra en la plantilla recién sintetizada dan como resultado una red de ADN hiperramificado. La desramificación de la secuencia durante la amplificación da como resultado un alto rendimiento de los productos. Para separar la red de ramificación del ADN, se utilizan nucleasas S1 para escindir los fragmentos en los sitios de desplazamiento. Las muescas en los fragmentos de ADN resultantes se reparan por la ADN polimerasa I .
La MDA puede generar de 1 a 2 µg de ADN a partir de una sola célula con una cobertura del genoma de hasta el 99%. [4] Los productos también tienen una tasa de error más baja y tamaños más grandes en comparación con la amplificación Taq basada en PCR . [4] [5]
