La polimerasa Taq es una ADN polimerasa termoestable que recibí el nombre delmicroorganismo eubacteriano termófilo Thermus aquaticus , del cual fue aislada originalmente por Chien et al. en 1976. [1] Su nombre a menudo se abrevia como Taq o Taq pol . Se utiliza con frecuencia en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar en gran medida la cantidad de segmentos cortos de ADN .
ADN polimerasa I, termoestable | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | polA | |||||
UniProt | P19821 | |||||
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T. aquaticus es una bacteria que vive en fuentes termales y respiraderos hidrotermales , y la polimerasa Taq fue identificada [1] como una enzima capaz de resistir las condiciones de desnaturalización de proteínas (alta temperatura) requeridas durante la PCR. [2] Por lo tanto, reemplazó la ADN polimerasa de E. coli utilizada originalmente en la PCR. [3]
Propiedades enzimáticas
La temperatura óptima de actividad de Taq es de 75 a 80 ° C, con una vida media de más de 2 horas a 92,5 ° C, 40 minutos a 95 ° C y 9 minutos a 97,5 ° C, y puede replicar un par de bases de 1000 hebra de ADN en menos de 10 segundos a 72 ° C. [4] A 75-80 ° C, Taq alcanza su tasa de polimerización óptima de aproximadamente 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima, y cualquier desviación del rango de temperatura óptima inhibe la tasa de extensión de la enzima. Una sola Taq sintetiza aproximadamente 60 nucleótidos por segundo a 70 ° C, 24 nucleótidos / seg a 55 ° C, 1,5 nucleótidos / seg a 37 ° C y 0,25 nucleótidos / seg a 22 ° C. A temperaturas superiores a 90 ° C, Taq demuestra muy poca o ninguna actividad, pero la enzima en sí no se desnaturaliza y permanece intacta. [5] La presencia de ciertos iones en el recipiente de reacción también afecta la actividad específica de la enzima. Pequeñas cantidades de cloruro de potasio (KCl) e iones de magnesio (Mg 2+ ) promueven la actividad enzimática de Taq . La polimerasa Taq se activa al máximo con KCl 50 mM y la concentración justa de Mg 2+ que se determina mediante la concentración de trifosfatos de nucleósidos (dNTP). Las altas concentraciones de KCl y Mg 2+ inhiben la actividad de Taq . [6] Curiosamente, el quelante de iones metálicos común, EDTA , se une directamente a Taq en ausencia de estos iones metálicos. [7]
Uno de los inconvenientes de Taq es su falta de actividad de corrección de pruebas de exonucleasa 3 ' a 5' [4], lo que resulta en una fidelidad de replicación relativamente baja. Originalmente, su tasa de error se midió en aproximadamente 1 en 9.000 nucleótidos. [8] Algunas ADN polimerasas termoestables se han aislado de otras bacterias termófilas y arqueas, como la ADN polimerasa Pfu , que poseen una actividad de corrección de pruebas y se utilizan en lugar de (o en combinación con) Taq para la amplificación de alta fidelidad. [9] La fidelidad puede variar mucho entre Taq, lo que tiene profundos efectos en las aplicaciones de secuenciación descendente. [10]
Taq fabrica productos de ADN que tienen proyecciones de A ( adenina ) en sus extremos 3 '. Esto puede ser útil en la clonación de TA , mediante el cual se utiliza un vector de clonación (como un plásmido ) que tiene una proyección 3 'de T ( timina ), que se complementa con la proyección A del producto de PCR, lo que permite la ligación del producto de PCR en el vector plásmido.
En PCR
A principios de la década de 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintéticos a la biotecnología . Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para la unión a cadenas de ADN diana, así como su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc . En 1983, comenzó a usar dos cebadores, uno para hibridar con cada hebra de un ADN objetivo y agregar ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a una replicación exponencial del ADN , [11] amplificando en gran medida segmentos discretos de ADN entre los cebadores. [3]
Sin embargo, después de cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse por encima de 90 ° C para desnaturalizar el ADN recién formado, permitiendo que las hebras se separen y actúen como plantillas en la siguiente ronda de amplificación. Este paso de calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que estaba en uso antes del descubrimiento de la polimerasa Taq , el fragmento de Klenow (procedente de E. coli ). La polimerasa Taq es muy adecuada para esta aplicación porque es capaz de soportar la temperatura de 95 ° C que se requiere para la separación de la cadena de ADN sin desnaturalizar.
El uso de Taq termoestable permite ejecutar la PCR a alta temperatura (~ 60 ° C y más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos no específicos, como el dímero de cebadores . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de agregar una nueva enzima a cada ciclo de termociclado. Se puede utilizar un solo tubo cerrado en una máquina relativamente sencilla para llevar a cabo todo el proceso. Por lo tanto, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN. [2]
Problemas de patentes
Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes de PCR y Taq de Cetus por $ 330 millones, de los cuales pudo haber recibido hasta $ 2 mil millones en regalías. [12] En 1989, Science Magazine nombró a la polimerasa Taq como su primera " Molécula del año ". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por investigaciones realizadas en una empresa de biotecnología . A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con Taq se estaba utilizando polimerasa en muchas áreas, incluyendo la investigación básica biología molecular, pruebas clínicas , y medicina forense . También comenzó a encontrar una aplicación urgente en la detección directa del VIH en el SIDA . [13]
En diciembre de 1999, el juez federal de distrito Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 que involucraba la polimerasa Taq se emitió, en parte, por información engañosa y afirmaciones falsas de científicos de Cetus Corporation . El fallo apoyó una impugnación de Promega Corporation contra Hoffman-La Roche , que compró las patentes de Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos anteriores de otros laboratorios, incluido el laboratorio del profesor John Trela en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Cincinnati , como el base de la sentencia. [14]
Estructura de dominio
Taq polimerasa, exonucleasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | Taq-exonuc | |||||||
Pfam | PF09281 | |||||||
InterPro | IPR015361 | |||||||
SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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Taq PolA tiene una estructura general similar a la de E. coli PolA. El dominio de exonucleasa 3'-5 'central responsable de la corrección de pruebas ha cambiado drásticamente y no es funcional. [15] Tiene un dominio de exonucleasa funcional 5'-3 'en el terminal amino, que se describe a continuación. Los dos dominios restantes actúan en coordinación, a través del movimiento de dominio acoplado. [dieciséis]
Dominio de exonucleasa
La exonucleasa de la polimerasa Taq es un dominio que se encuentra en el extremo amino de la ADN polimerasa Ide Taq (termoestable). Supone una ribonucleasa H-como adorno . El dominio confiereactividad exonucleasa 5 ' -3' a la polimerasa. [17]
A diferencia del mismo dominio en E. coli , que degradaría los cebadores y debe eliminarse mediante digestión para el uso de PCR, [9] no se dice que este dominio degrade el cebador. [18] Esta actividad se utiliza en la sonda TaqMan : a medida que se forman las hebras hijas, las sondas complementarias a la plantilla entran en contacto con la polimerasa y se escinden en trozos fluorescentes. [19]
Unión con ADN
La polimerasa Taq está unida en su hendidura del sitio activo de la polimerasa con el extremo romo del ADN dúplex. A medida que la polimerasa Taq está en contacto con el ADN unido, sus cadenas laterales forman enlaces de hidrógeno con las purinas y pirimidinas del ADN. La misma región de la polimerasa Taq que se ha unido al ADN también se une a la exonucleasa. Estas estructuras unidas a la polimerasa Taq tienen diferentes interacciones.
Mutantes
Se ha informado de un experimento de mutagénesis dirigida al sitio que mejora la actividad de la exonucleasa vestigal 3'-5 'en un factor de 2, pero nunca se informó si al hacerlo se reduce la tasa de error. [20] Siguiendo una línea de pensamiento similar, las proteínas quimeras se han elaborado seleccionando dominios de E. coli , Taq y T. neapolitana polimerasa I. Al intercambiar el dominio vestigal por uno funcional de E. coli se creó una proteína con capacidad de corrección de pruebas pero una temperatura óptima más baja y baja termoestabilidad. [21]
Se han producido versiones de la polimerasa sin el dominio de exonucleasa 5'-3 ', entre las que se conocen mejor Klentaq o el fragmento Stoffel . La completa falta de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que exhiben una estructura secundaria así como para copiar moléculas circulares. [9] Otras variaciones incluyen el uso de Klen Taq con una polimerasa de alta fidelidad, una termosequenasa que reconoce sustratos como ADN polimerasa T7 hace, mutantes con mayores tolerancias a los inhibidores, o versiones "dominio de etiquetado como" que tienen un extra de hélice-horquilla-hélice motivo alrededor del sitio catalítico para sujetar el ADN con más fuerza a pesar de las condiciones adversas. [22]
Importancia en la detección de enfermedades
Debido a las mejoras que proporciona la polimerasa Taq en la replicación del ADN por PCR: mayor especificidad, menos productos inespecíficos y procesos y equipos más simples, ha sido fundamental en los esfuerzos realizados para detectar enfermedades. "El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ha dado como resultado la capacidad de diagnosticar temprano y tratar adecuadamente las enfermedades debidas a patógenos exigentes, determinar la susceptibilidad antimicrobiana de organismos de crecimiento lento y determinar la cantidad de infección". [23] La implementación de la polimerasa Taq ha salvado innumerables vidas. Ha desempeñado un papel fundamental en la detección de muchas de las peores enfermedades del mundo, entre ellas: tuberculosis, faringitis estreptocócica, neumonía atípica, sida, sarampión, hepatitis e infecciones urogenitales ulcerativas. La PCR, el método utilizado para recrear copias de muestras de ADN específicas, hace posible la detección de enfermedades al dirigirse a una secuencia de ADN específica de un patógeno específico de la muestra de un paciente y amplificar trazas de las secuencias indicativas al copiarlas hasta miles de millones de veces. Aunque este es el método más preciso de detección de enfermedades, especialmente para el VIH, no se realiza con tanta frecuencia como pruebas alternativas inferiores debido al costo, la mano de obra y el tiempo relativamente altos que se requieren. [24]
La dependencia de la polimerasa Taq como catalizador para el proceso de replicación por PCR se destacó durante la pandemia COVID-19 de 2020. La escasez de la enzima necesaria ha afectado la capacidad de los países de todo el mundo para producir kits de prueba para el virus. Sin la polimerasa Taq , el proceso de detección de enfermedades es mucho más lento y tedioso. [25]
A pesar de las ventajas de utilizar la polimerasa Taq en la detección de enfermedades por PCR, la enzima no está exenta de deficiencias. Enfermedades retrovirales: VIH, HTLV-1 y HTLV-II; a menudo incluyen mutaciones de guanina a adenina en su genoma. Mutaciones como estas son las que permiten que las pruebas de PCR detecten las enfermedades, pero la tasa de fidelidad relativamente baja de la polimerasa Taq hace que se produzca la misma mutación G-a-A y posiblemente produzca un resultado de prueba falso positivo. [26]
Ver también
- Máquinas biológicas
- ADN polimerasa I
- Replicación de ADN
- Catálisis enzimática
- Dinámica del dominio de proteínas
Referencias
- ↑ a b Chien A, Edgar DB, Trela JM (septiembre de 1976). "Polimerasa de ácido desoxirribonucleico del termófilo extremo Thermus aquaticus" . Revista de bacteriología . 127 (3): 1550–7. doi : 10.1128 / jb.127.3.1550-1557.1976 . PMC 232952 . PMID 8432 .
- ^ a b Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al. (Enero de 1988). "Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebadores con una ADN polimerasa termoestable" . Ciencia . 239 (4839): 487–91. Código bibliográfico : 1988Sci ... 239..487S . doi : 10.1126 / science.239.4839.487 . PMID 2448875 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ a b Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (diciembre de 1985). "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de beta-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia falciforme" . Ciencia . 230 (4732): 1350–4. Código Bibliográfico : 1985Sci ... 230.1350S . doi : 10.1126 / science.2999980 . PMID 2999980 . Archivado desde el original el 19 de diciembre de 2008.
- ^ a b Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (mayo de 1993). "Expresión de alto nivel, purificación y caracterización enzimática de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus de longitud completa y una forma truncada deficiente en actividad exonucleasa 5 'a 3'" . Métodos y aplicaciones de PCR . 2 (4): 275–87. doi : 10.1101 / gr.2.4.275 . PMID 8324500 .
- ^ Protocolos de PCR: una guía de métodos y aplicaciones . Innis, Michael A. San Diego: Academic Press. 1990. ISBN 978-0123721808. OCLC 19723112 .CS1 maint: otros ( enlace )
- ^ Tecnología de PCR: principios y aplicaciones para la amplificación de ADN . Erlich, Henry A., 1943-. Nueva York: Stockton Press. 1989.ISBN 978-0333489482. OCLC 19323242 .CS1 maint: otros ( enlace )
- ^ Lopata A, Jójárt B, Surányi ÉV, Takács E, Bezúr L, Leveles I, et al. (Octubre de 2019). "Más allá de la quelación: EDTA une firmemente la ADN polimerasa Taq, MutT y dUTPasa e inhibe directamente la actividad de dNTPasa" . Biomoléculas . 9 (10): 621. doi : 10.3390 / biom9100621 . PMC 6843921 . PMID 31627475 .
- ^ Tindall KR, Kunkel TA (agosto de 1988). "Fidelidad de la síntesis de ADN por la ADN polimerasa de Thermus aquaticus". Bioquímica . 27 (16): 6008-13. doi : 10.1021 / bi00416a027 . PMID 2847780 .
- ^ a b c van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq y otras ADN polimerasas termoestables". Principios y aspectos técnicos de la amplificación por PCR . págs. 103-18. doi : 10.1007 / 978-1-4020-6241-4_7 . ISBN 978-1-4020-6240-7.
- ^ Brandariz-Fontes C, Camacho-Sanchez M, Vilà C, Vega-Pla JL, Rico C, Leonard JA (enero de 2015). "Efecto de las condiciones de la enzima y la PCR sobre la calidad de los resultados de la secuenciación de ADN de alto rendimiento" . Informes científicos . 5 : 8056. Código Bibliográfico : 2015NatSR ... 5E8056B . doi : 10.1038 / srep08056 . PMC 4306961 . PMID 25623996 .
- ^ Mullis KB (abril de 1990). "El origen inusual de la reacción en cadena de la polimerasa". Scientific American . 262 (4): 56–61, 64–5. Código Bibliográfico : 1990SciAm.262d..56M . doi : 10.1038 / scientificamerican0490-56 . PMID 2315679 .
- ^ Fore J, Wiechers IR, Cook-Deegan R (julio de 2006). "Los efectos de las prácticas comerciales, las licencias y la propiedad intelectual en el desarrollo y la difusión de la reacción en cadena de la polimerasa: estudio de caso" . Revista de Descubrimiento y Colaboración Biomédica . 1 : 7. doi : 10.1186 / 1747-5333-1-7 . PMC 1523369 . PMID 16817955 .
Historia detallada de Cetus Corporation y los aspectos comerciales de la PCR. - ^ Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (abril de 1989). "Amplificación de ácidos nucleicos in vitro: detección de secuencias con bajo número de copias y aplicación al diagnóstico de infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1" . Revisiones de microbiología clínica . 2 (2): 217-26. doi : 10.1128 / CMR.2.2.217 . PMC 358112 . PMID 2650862 .
- ^ Curran, Chris, Bio-Medicine, 7 de diciembre de 1999
- ^ Eom SH, Wang J, Steitz TA (julio de 1996). "Estructura de la polimerasa Taq con ADN en el sitio activo de la polimerasa". Naturaleza . 382 (6588): 278–81. Código Bibliográfico : 1996Natur.382..278E . doi : 10.1038 / 382278a0 . PMID 8717047 .
- ^ Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (diciembre de 2005). "Movimiento de dominio de proteína acoplado en polimerasa Taq revelado por espectroscopia de eco de espín de neutrones" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (49): 17646–51. Código Bibliográfico : 2005PNAS..10217646B . doi : 10.1073 / pnas.0503388102 . PMC 1345721 . PMID 16306270 .
- ^ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (agosto de 1999). "Diseño basado en la estructura de las polimerasas de ADN Taq con propiedades mejoradas de incorporación de didesoxinucleótidos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (17): 9491–6. Código Bibliográfico : 1999PNAS ... 96.9491L . doi : 10.1073 / pnas.96.17.9491 . PMC 22236 . PMID 10449720 .
- ^ "¿La actividad de endonucleasa de colgajo 5 '→ 3' de la ADN polimerasa Taq degradará los cebadores?" . NEB . Consultado el 28 de marzo de 2019 .
- ^ Expresión del gen TaqMan - Proyectos NCBI
- ^ Park Y, Choi H, Lee DS, Kim Y (junio de 1997). "Mejora de la actividad exonucleasa 3'-5 'de la ADN polimerasa Taq mediante ingeniería de proteínas en el sitio activo" . Moléculas y Células . 7 (3): 419–24. PMID 9264032 .
- ^ Villbrandt B, Sobek H, Frey B, Schomburg D (septiembre de 2000). "Intercambio de dominios: quimeras de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa I de Escherichia coli y ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana" . Ingeniería de proteínas . 13 (9): 645–54. doi : 10.1093 / proteína / 13.9.645 . PMID 11054459 .
- ^ Ishino S, Ishino Y (2014). "ADN polimerasas como reactivos útiles para la biotecnología - la historia de la investigación del desarrollo en el campo" . Fronteras en microbiología . 5 : 465. doi : 10.3389 / fmicb.2014.00465 . PMC 4148896 . PMID 25221550 .
- ^ Menon PK, Kapila K, Ohri VC (julio de 1999). "Reacción en cadena de la polimerasa y avances en el diagnóstico de enfermedades infecciosas" . Revista médica, Fuerzas Armadas de la India . 55 (3): 229–231. doi : 10.1016 / S0377-1237 (17) 30450-1 . PMC 5531883 . PMID 28775636 .
- ^ "Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)" . stanfordhealthcare.org . Consultado el 23 de abril de 2020 .
- ^ "El jefe de la FDA advierte de la 'presión' de suministro sobre los reactivos para las pruebas de coronavirus" . Buceo MedTech . Consultado el 23 de abril de 2020 .
- ^ Overbaugh J, Jackson SM, Papenhausen MD, Rudensey LM (noviembre de 1996). "Los genomas lentivirales con hipermutación G-a-A pueden resultar de errores de polimerasa Taq durante la reacción en cadena de la polimerasa". Investigación del SIDA y retrovirus humanos . 12 (17): 1605-13. doi : 10.1089 / aid.1996.12.1605 . PMID 8947295 .