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ADN polimerasa I
PolymeraseDomains.jpg
Dominios funcionales en el fragmento de Klenow (izquierda) y la ADN polimerasa I (derecha).
Identificadores
OrganismoEscherichia coli
(str. K-12 substr. MG1655)
SímbolopolA
Entrez948356
PDB1 DPI
RefSeq (Prot)NP_418300.1
UniProtP00582
Otros datos
Número CE2.7.7.7
Cromosomagenoma: 4.04 - 4.05 Mb
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EstructurasModelo suizo
DominiosInterPro

La ADN polimerasa I (o Pol I ) es una enzima que participa en el proceso de replicación del ADN procariota . Descubierta por Arthur Kornberg en 1956, [1] fue la primera ADN polimerasa conocida (y la primera conocida de cualquier tipo de polimerasa ). Inicialmente se caracterizó en E. coli y es omnipresente en procariotas . En E. coli y muchas otras bacterias, el gen que codifica Pol I se conoce como polA . La forma E. coli de la enzima se compone de 928 aminoácidos y es un ejemplo deenzima procesiva : puede catalizar secuencialmente múltiples polimerizaciones sin liberar la plantilla monocatenaria. [2] La función fisiológica de Pol I es principalmente reparar cualquier daño con el ADN, pero también sirve para conectar fragmentos de Okazaki eliminando cebadores de ARN y reemplazando la hebra con ADN.

Descubrimiento [ editar ]

En 1956, Arthur Kornberg y sus colegas descubrieron Pol I utilizando extractos de Escherichia coli ( E. coli ) para desarrollar un ensayo de síntesis de ADN. Los científicos agregaron timidina marcada con 14 C para poder recuperar un polímero radiactivo de ADN, no ARN. Para iniciar la purificación de la ADN polimerasa, los científicos agregaron sulfato de estreptomicina a la E. coliextracto que creó un precipitado que consistía en sobrenadante sin ácido nucleico (fracción S) y precipitado que contenía ácido nucleico (fracción P). Se descubrió que la fracción P contenía Pol I y factores termoestables que eran esenciales para que las reacciones de síntesis de ADN sufrieran temperaturas extremas. Estos factores se identificaron como nucleósidos trifosfatos , los componentes básicos de los ácidos nucleicos. La fracción S contenía múltiples desoxinucleósido quinasas . [3] En 1959, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Arthur Kornberg y Severo Ochoa "por su descubrimiento de los mecanismos involucrados en la síntesis biológica de ácido ribonucleico y ácido desoxirribonucleico.. " [4]

Arthur Kornberg 1969

Estructura y función [ editar ]

Estructura general [ editar ]

Pol I funciona principalmente en la reparación del ADN dañado. Pol I es parte de la clase de proteínas de la superfamilia de proteínas alfa / beta, que consta de segmentos alfa y beta que se encuentran dispersos por cualquier proteína dada. El ADN Pol I de E. coli consta de cuatro dominios con dos actividades enzimáticas separadas. El cuarto dominio consiste en una exonucleasa que corrige el producto del ADN Pol I y es capaz de eliminar cualquier error cometido por Pol I. Los otros tres dominios trabajan juntos para mantener la actividad de la ADN polimerasa. [5]

La bacteria E. coli contiene 5 ADN polimerasas diferentes: ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, ADN Pol IV y ADN Pol V. Las células eucariotas contienen 5 ADN polimerasas diferentes: α, β, γ, δ y ε. [6] La ADN polimerasa β eucariota es más similar a la ADN Pol I de E. coli porque su función principal está asociada con la reparación del ADN, más que con la replicación. La ADN polimerasa β se utiliza principalmente en la reparación por escisión de bases y la reparación por escisión de nucleótidos. [7] Se han identificado un total de 15 ADN polimerasas humanas. [8]

Similitud estructural y funcional con otras polimerasas [ editar ]

Péptido de unión a primasa compartido en Archaeal PolD y Eucariota Polα

En la replicación del ADN, la cadena principal de ADN se extiende continuamente en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, mientras que la cadena retrasada del ADN corre discontinuamente en la dirección opuesta a los fragmentos Okazaki . [9] Las ADN polimerasas tampoco pueden iniciar cadenas de ADN, por lo que deben ser iniciadas por segmentos cortos de ARN o ADN conocidos como cebadores. [5] Para que tenga lugar la polimerización del ADN, se deben cumplir dos requisitos. En primer lugar, todas las ADN polimerasas deben tener tanto una hebra molde como una hebra cebadora. A diferencia del ARN, las ADN polimerasas no pueden sintetizar ADN a partir de una hebra molde. La síntesis debe ser iniciada por un segmento corto de ARN, conocido como cebador de ARN , sintetizado por Primaseen la dirección de 5 'a 3'. La síntesis de ADN se produce luego mediante la adición de un dNTP al grupo hidroxilo 3 'al final de la cadena de ADN o cebador de ARN preexistente. En segundo lugar, las ADN polimerasas solo pueden agregar nuevos nucleótidos a la hebra preexistente a través de enlaces de hidrógeno. [6] Dado que todas las ADN polimerasas tienen una estructura similar, todas comparten un mecanismo de polimerasa catalizada por iones de dos metales. Uno de los iones metálicos activa el grupo hidroxilo 3 'del cebador, que luego ataca el fosfato 5' primario del dNTP. El segundo ion metálico estabilizará la carga negativa del oxígeno saliente y, posteriormente, quela los dos grupos fosfato que salen. [10]

Se ha dicho que las estructuras de rayos X del dominio de la polimerasa de todas las ADN polimerasas se parecen a las de la mano derecha de un ser humano. Todas las ADN polimerasas contienen tres dominios. El primer dominio, que se conoce como el "dominio de los dedos", interactúa con el dNTP y la base de la plantilla emparejada. El "dominio de los dedos" también interactúa con la plantilla para colocarla correctamente en el sitio activo. [11] Conocido como el "dominio de la palma", el segundo dominio cataliza la reacción de transferencia del grupo fosforilo. Por último, el tercer dominio, que se conoce como el "dominio del pulgar", interactúa con el ADN de doble hebra. [12]El dominio de exonucleasa contiene su propio sitio catalítico y elimina las bases mal emparejadas. Entre las siete familias de ADN polimerasa diferentes, el "dominio de la palma" se conserva en cinco de estas familias. El "dominio del dedo" y el "dominio del pulgar" no son consistentes en cada familia debido a la variación de los elementos de la estructura secundaria de diferentes secuencias. [11]

Función [ editar ]

Pol I posee cuatro actividades enzimáticas:

  1. Una actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN 5 '→ 3' (directa), que requiere un sitio de cebador 3 ' y una hebra molde
  2. Una actividad de exonucleasa 3 '→ 5' (inversa) que media la corrección
  3. Una actividad de exonucleasa 5 '→ 3' (directa) que media la traducción de la mella durante la reparación del ADN .
  4. Una actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN 5 '→ 3' (directo). Pol I opera sobre moldes de ARN con una eficiencia considerablemente menor (0,1-0,4%) que sobre moldes de ADN, y esta actividad probablemente sólo tiene una importancia biológica limitada. [13]

Para determinar si Pol I se utilizó principalmente para la replicación del ADN o en la reparación del daño del ADN, se llevó a cabo un experimento con una cepa mutante de Pol I deficiente de E. coli . La cepa mutante que carecía de Pol I se aisló y se trató con un mutágeno. La cepa mutante desarrolló colonias bacterianas que continuaron creciendo normalmente y que también carecían de Pol I. Esto confirmó que Pol I no era necesario para la replicación del ADN. Sin embargo, la cepa mutante también mostró características que involucraron una sensibilidad extrema a ciertos factores que dañaban el ADN, como la luz ultravioleta . Por lo tanto, esto reafirmó que era más probable que Pol I participara en la reparación del daño del ADN que en la replicación del ADN. [6]

Mecanismo [ editar ]

En el proceso de replicación, la ARNasa H elimina el cebador de ARN (creado por primasa ) de la hebra rezagada y luego la polimerasa I llena los nucleótidos necesarios entre los fragmentos de Okazaki (ver replicación del ADN ) en una dirección 5 '→ 3', corrigiendo errores Como va. Es una enzima dependiente de la plantilla: solo agrega nucleótidos que se emparejan correctamente con una cadena de ADN existente que actúa como plantilla. Es crucial que estos nucleótidos se encuentren en la orientación y geometría adecuadas para emparejarse de bases con la hebra de la plantilla de ADN para que la ligasa de ADNpuede unir los diversos fragmentos en una cadena continua de ADN . Los estudios de la polimerasa I han confirmado que diferentes dNTP pueden unirse al mismo sitio activo en la polimerasa I. La polimerasa I es capaz de discriminar activamente entre los diferentes dNTP solo después de que sufre un cambio conformacional . Una vez que se ha producido este cambio, Pol I comprueba la geometría adecuada y la alineación adecuada del par de bases, formado entre el dNTP unido y una base coincidente en la hebra de la plantilla. La geometría correcta de los pares de bases A = T y G≡C son los únicos que pueden caber en el sitio activo . Sin embargo, es importante saber que uno de cada 10 4 a 10 5los nucleótidos se agregan incorrectamente. Sin embargo, Pol I puede corregir este error en la replicación del ADN utilizando su método selectivo de discriminación activa. [5]

A pesar de su caracterización temprana, rápidamente se hizo evidente que la polimerasa I no era la enzima responsable de la mayor parte de la síntesis de ADN: la replicación del ADN en E. coli avanza a aproximadamente 1,000 nucleótidos / segundo, mientras que la tasa de síntesis de pares de bases por la polimerasa I promedia solo entre 10 y 20 nucleótidos / segundo. Además, su abundancia celular de aproximadamente 400 moléculas por célula no se correlacionó con el hecho de que típicamente solo hay dos horquillas de replicación en E. coli . Además, es insuficientemente procesivo para copiar un genoma completo , ya que se cae después de incorporar solo de 25 a 50 nucleótidos . Su papel en la replicación quedó probado cuando, en 1969,John Cairns aisló una polimerasa I mutante viable que carecía de actividad polimerasa. [14] La asistente de laboratorio de Cairns, Paula De Lucia, creó miles de extractos libres de células de colonias de E. coli y los analizó para determinar la actividad de la ADN polimerasa. El clon 3478º contenía el mutante polA , que fue nombrado por Cairns para dar crédito a "Paula" [De Lucia]. [15] No fue hasta el descubrimiento de la ADN polimerasa III que finalmente se identificó la principal ADN polimerasa replicativa.

Aplicaciones de investigación [ editar ]

ADN polimerasa I: fragmento de Klenow (PDB 1KLN EBI) [16]

La ADN polimerasa I obtenida de E. coli se usa ampliamente para la investigación de biología molecular . Sin embargo, la actividad exonucleasa 5 '→ 3' la hace inadecuada para muchas aplicaciones. Esta actividad enzimática indeseable puede eliminarse simplemente de la holoenzima para dejar una molécula útil llamada fragmento de Klenow , ampliamente utilizada en biología molecular . De hecho, el fragmento de Klenow se utilizó durante los primeros protocolos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta que se descubrió Thermus aquaticus , la fuente de una Taq Polimerasa I tolerante al calor , en 1976. [17] Exposición de la ADN polimerasa I a la proteasa subtilisina divide la molécula en un fragmento más pequeño, que retiene solo la ADN polimerasa y las actividades de corrección de pruebas.

Ver también [ editar ]

  • ADN polimerasa II
  • ADN polimerasa III
  • ADN polimerasa V

Referencias [ editar ]

  1. ^ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (julio de 1958). "Síntesis enzimática de ácido desoxirribonucleico. I. Preparación de sustratos y purificación parcial de una enzima de Escherichia coli " . La Revista de Química Biológica . 233 (1): 163–70. PMID  13563462 .
  2. ^ Voet D, Voet JG, Pratt CW (1999). Fundamentos de Bioquímica . Nueva York: Wiley.[ página necesaria ]
  3. ^ Lehman IR (septiembre de 2003). "Descubrimiento de la ADN polimerasa" . La Revista de Química Biológica . 278 (37): 34733–8. doi : 10.1074 / jbc.X300002200 . PMID 12791679 . 
  4. ^ "El Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1959" . www.nobelprize.org . Consultado el 8 de noviembre de 2016 .
  5. ↑ a b c Cox MM, Doudna J (2015). Biología Molecular (2ª ed.). Nueva York: WH Freeman.[ página necesaria ]
  6. ↑ a b c Cooper, Geoffrey M. Geoffrey (1 de enero de 2000). "Replicación del ADN" . Cite journal requiere |journal=( ayuda )
  7. ^ Wood RD, Shivji MK (abril de 1997). "¿Qué ADN polimerasas se utilizan para la reparación del ADN en eucariotas?" . Carcinogénesis . 18 (4): 605–10. doi : 10.1093 / carcin / 18.4.605 . PMID 9111189 . 
  8. ^ Biertümpfel C, Zhao Y, Kondo Y, Ramón-Maiques S, Gregory M, Lee JY, Masutani C, Lehmann AR, Hanaoka F, Yang W (junio de 2010). "Estructura y mecanismo de la ADN polimerasa eta humana" . Naturaleza . 465 (7301): 1044–8. Código Bibliográfico : 2010Natur.465.1044B . doi : 10.1038 / nature09196 . PMC 2899710 . PMID 20577208 .  
  9. ^ Hübscher U, Spadari S, Villani G, Maga G (2010). ADN polimerasas . doi : 10.1142 / 7667 . ISBN 978-981-4299-16-9.[ página necesaria ]
  10. ^ "ADN polimerasa I: reacciones enzimáticas" .
  11. ^ a b "MBIO.4.14.5" . bioscience.jbpub.com . Consultado el 14 de mayo de 2017 .
  12. ^ Loeb LA, Monnat RJ (agosto de 2008). "ADN polimerasas y enfermedades humanas". Nature Reviews Genética . 9 (8): 594–604. doi : 10.1038 / nrg2345 . PMID 18626473 . 
  13. ^ Ricchetti M, Buc H (febrero de 1993). " ADN polimerasa I de E. coli como transcriptasa inversa" . El diario EMBO . 12 (2): 387–96. PMC 413221 . PMID 7679988 .  
  14. ^ De Lucia P, Cairns J (diciembre de 1969). "Aislamiento de una cepa de E. coli con una mutación que afecta a la ADN polimerasa". Naturaleza . 224 (5225): 1164–6. Código Bibliográfico : 1969Natur.224.1164D . doi : 10.1038 / 2241164a0 . PMID 4902142 . 
  15. ^ Friedberg EC (febrero de 2006). "La enzima eureka: el descubrimiento de la ADN polimerasa". Nature Reviews Biología celular molecular . 7 (2): 143–7. doi : 10.1038 / nrm1787 . PMID 16493419 . 
  16. ^ EMBL-EBI. "Instituto Europeo de Bioinformática EMBL" . www.ebi.ac.uk . Consultado el 8 de noviembre de 2016 .
  17. ↑ van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq y otras ADN polimerasas termoestables". Principios y aspectos técnicos de la amplificación por PCR . págs. 103-18. doi : 10.1007 / 978-1-4020-6241-4_7 . ISBN 978-1-4020-6240-7.