En microscopía óptica , la inmersión en aceite es una técnica utilizada para aumentar el poder de resolución de un microscopio . Esto se logra sumergiendo tanto la lente del objetivo como la muestra en un aceite transparente de alto índice de refracción , aumentando así la apertura numérica de la lente del objetivo.
Sin aceite, las ondas de luz se reflejan en la muestra de portaobjetos a través del cubreobjetos de vidrio, a través del aire y hacia la lente del microscopio (vea la figura coloreada a la derecha). A menos que una onda salga en un ángulo de 90 grados, se retuerce cuando golpea una nueva sustancia, la cantidad de giro depende del ángulo. Esto distorsiona la imagen. El aire es muy diferente del vidrio, lo que le da un gran giro en comparación con el aceite, que es más similar al vidrio. Lo ideal sería que hubiera vidrio en el medio, pero se rompería. El petróleo es la mejor alternativa.
Los aceites de inmersión son aceites transparentes que tienen características ópticas y de viscosidad específicas necesarias para su uso en microscopía. Los aceites típicos utilizados tienen un índice de refracción de alrededor de 1,515. [1] Un objetivo de inmersión en aceite es una lente de objetivo especialmente diseñada para usarse de esta manera. Muchos condensadores también brindan una resolución óptima cuando la lente del condensador se sumerge en aceite.
Antecedentes teóricos
Las lentes reconstruyen la luz dispersada por un objeto. Para lograr este fin con éxito, lo ideal es que se recopilen todas las órdenes de difracción. Esto está relacionado con el ángulo de apertura de la lente y su índice de refracción. La resolución de un microscopio se define como la separación mínima necesaria entre dos objetos bajo examen para que el microscopio los distinga como objetos separados. Esta distancia mínima está etiquetada como δ. Si dos objetos están separados por una distancia menor que δ, aparecerán como un solo objeto en el microscopio.
Una medida del poder de resolución, RP, de una lente viene dada por su apertura numérica , NA:
donde λ es la longitud de onda de la luz. A partir de esto, queda claro que una buena resolución (δ pequeña) está relacionada con una alta apertura numérica.
La apertura numérica de una lente se define como
donde α 0 es la mitad del ángulo que abarca la lente del objetivo vista desde la muestra, yn es el índice de refracción del medio entre la lente y la muestra (≈1 para el aire).
Los objetivos de vanguardia pueden tener una apertura numérica de hasta 0,95. Debido a que sin α 0 es siempre menor o igual a la unidad (el número "1"), la apertura numérica nunca puede ser mayor que la unidad para una lente objetivo en el aire. Sin embargo, si el espacio entre la lente del objetivo y la muestra está lleno de aceite, la apertura numérica puede obtener valores superiores a la unidad. Esto se debe a que el aceite tiene un índice de refracción superior a 1.
Objetivos de inmersión en aceite
De lo anterior se entiende que el aceite entre la muestra y la lente del objetivo mejora el poder de resolución en un factor de 1 / n . Los objetivos diseñados específicamente para este propósito se conocen como objetivos de inmersión en aceite.
Los objetivos de inmersión en aceite se utilizan solo con aumentos muy grandes que requieren un alto poder de resolución. Los objetivos con aumento de alta potencia tienen distancias focales cortas , lo que facilita el uso de aceite. Se aplica aceite a la muestra (microscopio convencional) y se eleva la platina sumergiendo el objetivo en aceite. (En los microscopios invertidos, el aceite se aplica al objetivo).
Los índices de refracción del aceite y del vidrio en el primer elemento de la lente son casi iguales, lo que significa que la refracción de la luz será pequeña al entrar en la lente (el aceite y el vidrio son ópticamente muy similares). Se debe utilizar el aceite de inmersión correcto para una lente de objetivo para garantizar que los índices de refracción coincidan estrechamente. El uso de una lente de inmersión en aceite con el aceite de inmersión incorrecto, o sin aceite de inmersión por completo, sufrirá una aberración esférica. La fuerza de este efecto depende del tamaño del desajuste del índice de refracción.
La inmersión en aceite generalmente solo se puede usar en muestras montadas rígidamente, de lo contrario, la tensión superficial del aceite puede mover el cubreobjetos y, por lo tanto, mover la muestra por debajo. Esto también puede suceder en microscopios invertidos porque el cubreobjetos está debajo del portaobjetos.
Aceite de inmersión
Antes del desarrollo de los aceites de inmersión sintéticos en la década de 1940, el aceite de árbol de cedro se usaba ampliamente. El aceite de cedro tiene un índice de refracción de aproximadamente 1,516. La apertura numérica de los objetivos de aceite de árbol de cedro es generalmente alrededor de 1.3. Sin embargo, el aceite de cedro tiene una serie de desventajas: absorbe la luz azul y ultravioleta, amarillea con la edad, tiene suficiente acidez como para dañar potencialmente los objetivos con el uso repetido (al atacar el cemento usado para unir lentes ) y diluirlo con solvente cambia su viscosidad ( e índice de refracción y dispersión ). El aceite de cedro debe eliminarse del objetivo inmediatamente después de su uso antes de que pueda endurecerse, ya que eliminar el aceite de cedro endurecido puede dañar la lente. En la microscopía moderna, los aceites de inmersión sintéticos se utilizan con mayor frecuencia, ya que eliminan la mayoría de estos problemas. [2] Se pueden lograr valores NA de 1,6 con diferentes aceites. A diferencia de los aceites naturales, los sintéticos no se endurecen en la lente y, por lo general, se pueden dejar en el objetivo durante meses seguidos, aunque para mantener mejor un microscopio es mejor eliminar el aceite a diario. Con el tiempo, el aceite puede entrar por la lente frontal del objetivo o en el cañón del objetivo y dañar el objetivo.
Existen diferentes tipos de aceites de inmersión con diferentes propiedades según el tipo de microscopía que realizará. El tipo A y el tipo B son aceites de inmersión de uso general con diferentes viscosidades. [3] El aceite de inmersión de tipo F se utiliza mejor para obtener imágenes fluorescentes a temperatura ambiente (23 ° C), mientras que el aceite de tipo N está diseñado para usarse a temperatura corporal (37 ° C) para aplicaciones de imágenes de células vivas.
Ver también
Referencias
- ^ "Objetivos de microscopio: medios de inmersión" por Mortimer Abramowitz y Michael W. Davidson , Centro de recursos de microscopía de Olympus (sitio web), 2002.
- ^ Cargille, John (1985) [1964], "aceite de inmersión y el microscopio" , Nueva York microscópico Sociedad Anuario , Archivado desde el original en 2011-09-11 , recuperada 2008-01-21
- ^ Labs, Cargille. "Acerca de los aceites de inmersión" . Cargille Labs . Consultado el 4 de diciembre de 2019 .
- Microscopía práctica por LC Martin y BK Johnson, Glasgow (1966).
- Microscopía de luz por JK Solberg, Tapir Trykk (2000).
enlaces externos
- "Microscope Objectives: Immersion Media" por Mortimer Abramowitz y Michael W. Davidson, Olympus Microscopy Resource Center (sitio web), 2002.
- "Immersion Oil Microscopy" por David B. Fankhauser, Biología de la Universidad de Cincinnati , Clermont College (sitio web), 30 de diciembre de 2004.
- "Historia de las lentes de inmersión en aceite" por Jim Solliday, Museo del Suroeste de Ingeniería, Comunicaciones y Computación (sitio web), 2007.
- "Immersion Oil and the Microscope" por John J. Cargille, Anuario de la Sociedad Microscópica de Nueva York , 1964 (revisado, 1985). (Archivado en Cargille Labs (sitio web).)