La cromatografía periódica en contracorriente (PCC) es un método para ejecutar la cromatografía de afinidad de forma casi continua. En la actualidad, el proceso se emplea principalmente para la purificación de anticuerpos en la industria biofarmacéutica [1] , así como en la investigación y el desarrollo. Cuando se purifican anticuerpos, la proteína A se usa como matriz de afinidad. Sin embargo, se pueden aplicar procesos periódicos en contracorriente a cualquier cromatografía de tipo de afinidad. [2]
Principio básico
En la cromatografía de afinidad convencional , una sola columna de cromatografía se carga con material de alimentación hasta el punto en que el material de destino (producto) ya no puede ser retenido por el material de afinidad. A continuación, se lava la resina con el producto adsorbido para eliminar las impurezas. Finalmente, el producto puro se eluye con un tampón diferente. En particular, si se carga demasiado material de alimentación en la columna, el producto puede romperse y, en consecuencia, el producto se pierde. Por lo tanto, es muy importante cargar la columna solo parcialmente para maximizar el rendimiento.
La cromatografía periódica en contracorriente deja de lado este problema al utilizar más de una columna. Los procesos de PCC se pueden ejecutar con cualquier número de columnas, comenzando desde dos. [3] El siguiente párrafo explicará una versión de dos columnas de PCC, pero otros protocolos con más columnas se basan en los mismos principios (ver más abajo). A la derecha se muestra un diagrama que muestra los pasos individuales del proceso. En el Paso 1, la denominada fase de carga secuencial, las columnas 1 y 2 están interconectadas. La columna 1 está completamente cargada con la muestra (roja) mientras que su avance se captura en la columna 2. En el paso 2, la columna 1 se lava, eluye, limpia y reequilibra mientras la carga por separado continúa en la columna 2. En el paso 3, después de la regeneración de columna 1, las columnas están nuevamente interconectadas y la columna 2 está completamente cargada mientras que su avance se captura en la columna 1. Finalmente, en el Paso 4, la columna 2 se lava, eluye, limpia y reequilibra mientras la carga continúa independientemente en la columna 1. Este proceso cíclico se repite de forma continua.
Existen varias variaciones de cromatografía periódica en contracorriente con más de dos columnas. En estos casos, se colocan columnas adicionales dentro del flujo de alimentación durante la carga, lo que tiene el mismo efecto que usar columnas más largas. Alternativamente, las columnas adicionales se pueden mantener en un modo de espera desocupado durante la carga. Este modo ofrece una garantía adicional de que el proceso principal no se ve afectado por los protocolos de lavado y limpieza, aunque en la práctica esto rara vez se requiere. Por otro lado, las columnas subutilizadas reducen la productividad máxima teórica para tales procesos. Generalmente, las ventajas y desventajas de los diferentes protocolos de varias columnas son objeto de debate. [4] Sin embargo, sin duda alguna, en comparación con los procesos por lotes de una sola columna, los procesos periódicos en contracorriente proporcionan una productividad significativamente mayor.
Control de proceso dinámico
En la escala de tiempo de las ejecuciones de cromatografía continua, es bastante común observar cambios en parámetros importantes del proceso, como el estado de la columna, la calidad del tampón, el título (concentración) del alimento o la composición del alimento. Tales cambios dan como resultado una capacidad máxima de columna alterada, en relación con la cantidad de material de alimentación cargado. Por lo tanto, para lograr una calidad y un rendimiento constantes para cada ciclo de proceso, es necesario ajustar el tiempo de los pasos individuales del proceso. Los cambios manuales son en principio concebibles, pero poco prácticos. Más comúnmente, los algoritmos de control de procesos dinámicos monitorean los parámetros del proceso y aplican los cambios según sea necesario automáticamente.
Hay dos modos de funcionamiento diferentes para los controladores de procesos dinámicos que se utilizan en la actualidad (consulte la figura de la derecha). El primero, llamado DeltaUV, monitorea la diferencia entre dos señales de detectores situados antes y después de la primera columna. Durante la carga inicial, hay una gran diferencia entre las dos señales, pero está disminuyendo a medida que las impurezas atraviesan la columna. Una vez que la columna está completamente saturada de impurezas y solo se retiene producto adicional, la diferencia entre las señales alcanza un valor constante. Mientras el producto se capture completamente en la columna, la diferencia entre las señales permanecerá constante. Tan pronto como parte del producto atraviesa la columna (compare arriba), la diferencia disminuye. Por tanto, se puede determinar el momento y la cantidad de penetración del producto. La segunda posibilidad, denominada AutomAb, requiere solo la señal de un solo detector situado detrás de la primera columna. Durante la carga inicial, la señal aumenta, a medida que más y más impurezas atraviesan la columna. Cuando la columna está saturada de impurezas y mientras el producto se captura completamente en la columna, la señal permanece constante. Tan pronto como parte del producto atraviesa la columna (compare arriba), la señal aumenta nuevamente. Por tanto, se puede determinar de nuevo el momento y la cantidad de penetración del producto.
Ambas iteraciones funcionan igualmente bien en teoría. En la práctica, el requisito de dos señales sincronizadas y la exposición de un detector a material de alimentación no purificado hace que el enfoque de DetaUV sea menos confiable que AutomAb.
Situación comercial
A partir de 2017, GE Healthcare posee patentes sobre la cromatografía periódica en contracorriente de tres columnas: esta tecnología se utiliza en su instrumento Äkta PCC . [ cita requerida ] Del mismo modo, ChromaCon tiene patentes para una versión optimizada de dos columnas (CaptureSMB). [ Citación necesaria ] CaptureSMB se utiliza en ChromaCon 's Contichrom CUBO y bajo licencia en YMC ' s Ecoprime gemelas sistemas. Otros fabricantes de sistemas capaces de cromatografía periódica a contracorriente incluyen Novasep y Pall . [ cita requerida ]
Referencias
- ^ Warikoo, Veena; Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Cummings, Daniel; Simons, Elizabeth; Johnson, Timothy; Walther, Jason; Yu, Marcella; Wright, Benjamin; McLarty, Jean; Karey, Kenneth P .; Hwang, Chris; Zhou, Weichang; Riesgo, Frank; Konstantinov, Konstantin (diciembre de 2012). "Producción continua integrada de proteínas terapéuticas recombinantes". Biotecnología y Bioingeniería . 109 (12): 3018-3029. doi : 10.1002 / bit.24584 . PMID 22729761 . S2CID 20663834 .
- ^ Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Konstantinov, Konstantin; Riesgo, Frank; Warikoo, Veena (diciembre de 2012). "Cromatografía periódica a contracorriente: diseño y consideraciones operativas para la purificación integrada y continua de proteínas". Revista de biotecnología . 7 (12): 1496–1508. doi : 10.1002 / biot.201200068 . PMID 23070975 .
- ^ Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Baur, Daniel; Lievrouw, Roel; Lissens, Geert; Morbidelli, Massimo (abril de 2015). "CaptureSMB de doble columna: un nuevo proceso cíclico para la cromatografía de afinidad de proteína A". Journal of Chromatography A . 1389 : 85–95. doi : 10.1016 / j.chroma.2015.02.046 . PMID 25748537 .
- ^ Baur, Daniel; Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Steinebach, Fabián; Morbidelli, Massimo (julio de 2016). "Comparación de procesos de captura de proteína A multicolumna por lotes y continuos mediante un diseño óptimo". Revista de biotecnología . 11 (7): 920–931. doi : 10.1002 / biot.201500481 . PMID 26992151 .