Anticuerpos policlonales

Este artículo trata sobre la producción de anticuerpos in vivo. Para conocer sus aplicaciones médicas y biológicas, consulte Antisuero .

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Los anticuerpos policlonales (pAbs) son anticuerpos que son secretados por diferentes linajes de células B dentro del cuerpo (mientras que los anticuerpos monoclonales provienen de un solo linaje celular). Son una colección de moléculas de inmunoglobulina que reaccionan contra un antígeno específico , cada una identificando un epítopo diferente .

Producción

El procedimiento general para producir anticuerpos policlonales es el siguiente:

1. Preparación de antígeno
2. Selección y preparación de adyuvantes
3. Selección de animales
4. Proceso de inyeccion
5. Extracción de suero sanguíneo

Se inyecta un conjugado de antígeno / adyuvante en un animal de elección para iniciar una respuesta inmune amplificada. Después de una serie de inyecciones durante un período de tiempo específico, se espera que el animal haya creado anticuerpos contra el conjugado. Luego se extrae sangre del animal y luego se purifica para obtener el anticuerpo de interés.

La inoculación se realiza en un mamífero adecuado , como un ratón, un conejo o una cabra. A menudo se prefieren los mamíferos más grandes ya que la cantidad de suero que se puede recolectar es mayor. Se inyecta un antígeno en el mamífero. Esto induce a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG específicas para el antígeno. Esta IgG policlonal se purifica del suero del mamífero .

Por el contrario, los anticuerpos monoclonales se derivan de una única línea celular.

Existen muchas metodologías para la producción de anticuerpos policlonales en animales de laboratorio. Las pautas institucionales que rigen el uso de animales y los procedimientos relacionados con estas metodologías generalmente se orientan en torno a consideraciones humanas y conductas apropiadas para el uso de adyuvantes (agentes que modifican el efecto de otros agentes mientras tienen pocos o ningún efecto directo cuando se administran por sí mismos). Esto incluye la selección de adyuvantes, vías y sitios de administración, volúmenes de inyección por sitio y número de sitios por animal. Las políticas institucionales generalmente incluyen volúmenes permitidos de sangre por recolección y precauciones de seguridad, incluida la sujeción adecuada y la sedación o anestesia de los animales para prevenir lesiones a los animales o al personal.

El objetivo principal de la producción de anticuerpos en animales de laboratorio es obtener alto título , alta afinidad antisueros para su uso en la experimentación o pruebas de diagnóstico. Los adyuvantes se utilizan para mejorar o potenciar la respuesta inmunitaria a los antígenos. La mayoría de los adyuvantes proporcionan un lugar de inyección, un depósito de antígeno que permite una liberación lenta de antígeno en los ganglios linfáticos de drenaje.

Muchos adyuvantes también contienen o actúan directamente como:

1. tensioactivos que promueven la concentración de moléculas de antígenos proteicos en una gran superficie, y
2. moléculas o propiedades inmunoestimuladoras. Los adyuvantes se usan generalmente con antígenos proteicos solubles para aumentar los títulos de anticuerpos e inducir una respuesta prolongada con memoria acompañante.

Dichos antígenos por sí mismos son generalmente inmunógenos deficientes. La mayoría de los antígenos proteicos complejos inducen múltiples clones de células B durante la respuesta inmune, por lo que la respuesta es policlonal. Las respuestas inmunes a los antígenos no proteicos son generalmente deficientes o mejoradas por los adyuvantes y no hay memoria del sistema.

Actualmente también se están produciendo anticuerpos a partir del aislamiento de linfocitos B humanos para producir mezclas de anticuerpos monoclonales recombinantes específicos. La empresa de biotecnología Symphogen desarrolla este tipo de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas. Son la primera empresa de investigación en llegar a los ensayos de fase dos con las mezclas de anticuerpos monoclonales que imitan la diversidad de los fármacos de anticuerpos policlonales. Esta producción previene la transmisión viral y priónica y este es un proceso simple.

Selección de animales

Los animales que se utilizan con frecuencia para la producción de anticuerpos policlonales incluyen pollos, cabras, cobayas, hámsteres, caballos, ratones, ratas y ovejas. Sin embargo, el conejo es el animal de laboratorio más utilizado para este propósito. La selección de animales debe basarse en:

1. la cantidad de anticuerpo necesaria,
2. la relación entre el donante del antígeno y el productor de anticuerpos del receptor (generalmente, cuanto más distante es la relación filogenética, mayor es la posibilidad de una respuesta de anticuerpos de alto título) y
3. las características necesarias [por ejemplo, clase, subclase (isotipo), naturaleza de fijación del complemento] de los anticuerpos que se van a producir. La inmunización y las flebotomías están asociadas al estrés y, al menos cuando se utilizan conejos y roedores, se prefieren los animales libres de patógenos específicos (SPF). El uso de estos animales puede reducir drásticamente la morbilidad y la mortalidad debidas a organismos patógenos, especialmente Pasteurella multocida en conejos.

Generalmente se utilizan cabras o caballos cuando se requieren grandes cantidades de antisueros. Muchos investigadores favorecen a los pollos debido a su distancia filogenética de los mamíferos. Los pollos transfieren grandes cantidades de IgY (IgG) a la yema de huevo y la recolección de anticuerpos de los huevos elimina la necesidad del procedimiento de sangrado invasivo. Los huevos de una semana pueden contener 10 veces más anticuerpos que el volumen de sangre de conejo obtenida de una hemorragia semanal. Sin embargo, existen algunas desventajas cuando se utilizan ciertos anticuerpos derivados de pollo en inmunoensayos. La IgY de pollo no fija el componente C1 del complemento de mamífero y no actúa como un anticuerpo precipitante usando soluciones estándar.

Aunque los ratones se utilizan con mayor frecuencia para la producción de anticuerpos monoclonales, su pequeño tamaño normalmente impide su uso para cantidades suficientes de anticuerpos séricos policlonales. Sin embargo, los anticuerpos policlonales en ratones se pueden recolectar del líquido ascítico usando cualquiera de varias metodologías de producción de ascitis.

Cuando se utilizan conejos, se deben utilizar animales adultos jóvenes (de 2,5 a 3,0 kg o de 5,5 a 6,5 ​​libras) para la inmunización primaria debido a la vigorosa respuesta de los anticuerpos. La función inmunológica alcanza su punto máximo en la pubertad y las respuestas primarias a los nuevos antígenos disminuyen con la edad. Generalmente se prefieren los conejos hembras porque son más dóciles y se informa que desarrollan una respuesta inmune más vigorosa que los machos. Se deben utilizar al menos dos animales por antígeno cuando se utilizan animales consanguíneos. Este principio reduce el posible fallo total resultante de la falta de respuesta a los antígenos de los animales individuales.

Preparación de antígenos

El tamaño, el grado de agregación y la natividad relativa de los antígenos proteicos pueden afectar drásticamente la calidad y cantidad de anticuerpos producidos. Los polipéptidos pequeños (<10 ku ) y los antígenos no proteicos generalmente necesitan conjugarse o reticularse con proteínas portadoras inmunogénicas más grandes para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar epítopos de células T. Generalmente, cuanto mayor sea la proteína inmunogénica, mejor. Las proteínas más grandes, incluso en cantidades más pequeñas, generalmente dan como resultado una mejor participación de las células de procesamiento de antígeno presentadoras de antígeno para una respuesta inmune satisfactoria. La inyección de proteínas solubles no agregadas tiene una mayor probabilidad de inducir tolerancia en lugar de una respuesta de anticuerpos satisfactoria.

La hemocianina de lapa californiana (KLH) y la albúmina de suero bovino son dos proteínas transportadoras ampliamente utilizadas. La poli-L-lisina también se ha utilizado con éxito como columna vertebral de péptidos. Aunque el uso de Poli-L-lisina reduce o elimina la producción de anticuerpos contra proteínas extrañas, puede resultar en una falla en la producción de anticuerpos inducida por péptidos. Recientemente, los liposomas también se han utilizado con éxito para la administración de péptidos pequeños y esta técnica es una alternativa a la administración con adyuvantes de emulsión aceitosa.

Cantidad de antígeno

La selección de la cantidad de antígeno para la inmunización varía con las propiedades del antígeno y el adyuvante seleccionado. En general, se necesitan cantidades de microgramos a miligramos de proteína en el adyuvante para provocar anticuerpos con títulos elevados. La dosis de antígeno está asociada generalmente a la especie, más que al peso corporal. La denominada "ventana" de inmunogenicidad en cada especie es amplia, pero demasiado o muy poco antígeno puede inducir tolerancia, supresión o desviación inmunitaria hacia la inmunidad celular en lugar de una respuesta humoral satisfactoria. Se han informado niveles óptimos y habituales de antígenos proteicos para inmunizar especies específicas en los siguientes rangos:

1. conejo, 50-1.000 µg;
2. ratón, 10-50 µg;
3. conejillo de indias, 50-500 µg; y
4. cabra, 250–5000 µg.

Se informa que las dosis óptimas de "preparación" se encuentran en el extremo inferior de cada intervalo.

La afinidad de los anticuerpos séricos aumenta con el tiempo (meses) después de la inyección de mezclas de antígeno-adyuvante y a medida que disminuye el antígeno en el sistema. Las dosis de antígeno ampliamente utilizadas para las inmunizaciones "de refuerzo" o secundarias suelen ser la mitad para igualar las dosis de cebado. Los antígenos deben estar libres de subproductos preparativos y productos químicos como gel de poliacrilamida, SDS, urea, endotoxina, partículas y pH extremos.

Anticuerpos peptídicos

Cuando se utiliza un péptido para generar el anticuerpo, es extremadamente importante diseñar los antígenos correctamente. Existen varios recursos que pueden ayudar en el diseño así como empresas que ofrecen este servicio. Expasy ha agregado un conjunto de herramientas públicas en su página ProtScale que requieren cierto grado de conocimiento del usuario para navegar. Para una herramienta de puntuación de péptidos más simple, existe una herramienta de perfil de antígeno disponible que le permitirá puntuar secuencias de péptidos individuales en función de una base de datos de mapeo de epítopos de relación de inmunógenos anteriores utilizados para generar anticuerpos. Finalmente, como regla general, los péptidos deben seguir algunos criterios básicos.

Al examinar péptidos para síntesis e inmunización, se recomienda evitar ciertos residuos y secuencias debido a posibles problemas de síntesis. Esto incluye algunas de las características más comunes:

• Repeticiones extremadamente largas del mismo aminoácido (por ejemplo, RRRR)
• Dobletes de serina (S), treonina (T), alanina (A) y valina (V)
• Finalizar o iniciar una secuencia con prolina (P)
• Glutamina (Q) o asparagina (N) en el extremo n
• Péptidos sobreponderados con residuos hidrófobos (por ejemplo, V, A, L, I, etc.)

Reactividad

Los investigadores también deben considerar el estado de natividad de los antígenos proteicos cuando se utilizan como inmunógenos y la reacción con los anticuerpos producidos. Los anticuerpos contra las proteínas nativas reaccionan mejor con las proteínas nativas y los anticuerpos contra las proteínas desnaturalizadas reaccionan mejor con las proteínas desnaturalizadas. Si los anticuerpos producidos se van a utilizar en transferencias de membrana (proteínas sujetas a condiciones desnaturalizantes), entonces deben prepararse anticuerpos contra proteínas desnaturalizadas. Por otro lado, si se van a usar anticuerpos para reaccionar con una proteína nativa o bloquear un sitio activo de proteína, entonces se deben producir anticuerpos contra la proteína nativa. Los adyuvantes a menudo pueden alterar la natividad de la proteína. Generalmente, antígenos proteicos absorbidos en una emulsión de aceite en agua preformada adyuvante, retienen una estructura proteica nativa mayor que las de las emulsiones de agua en aceite.

Asepticidad

Los antígenos siempre deben prepararse utilizando técnicas que aseguren que están libres de contaminación microbiana. La mayoría de las preparaciones de antígenos proteicos se pueden esterilizar pasándolas a través de un filtro de 0,22 μm. Los abscesos sépticos ocurren a menudo en los sitios de inoculación de los animales cuando se utilizan preparaciones contaminadas. Esto puede resultar en un fracaso de la inmunización contra el antígeno diana.

Adyuvantes

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Hay muchos adyuvantes inmunológicos disponibles comercialmente.. La selección de adyuvantes o tipos específicos varía dependiendo de si se van a utilizar para la investigación y la producción de anticuerpos o en el desarrollo de vacunas. Los adyuvantes para uso de vacunas solo necesitan producir anticuerpos protectores y una buena memoria sistémica, mientras que aquellos para la producción de antisuero necesitan inducir rápidamente anticuerpos de alto título y alta avidez. Ningún adyuvante es ideal para todos los propósitos y todos tienen ventajas y desventajas. El uso de adyuvantes generalmente se acompaña de efectos secundarios indeseables de diversa gravedad y duración. La investigación de nuevos adyuvantes se centra en sustancias que tienen una toxicidad mínima y que conservan la máxima inmunoestimulación. Los investigadores siempre deben ser conscientes del dolor y la angustia potenciales asociados con el uso de adyuvantes en animales de laboratorio.

Los adyuvantes más utilizados para la producción de anticuerpos son Freund's, Alum, Ribi Adjuvant System y Titermax.

Adyuvantes de Freund

Hay dos tipos básicos de adyuvantes de Freund : adyuvante completo de Freund (FCA) y adyuvante incompleto de Freund (FIA). FCA es una emulsión de agua en aceite que localiza el antígeno durante períodos de liberación de hasta 6 meses. Está formulado con aceite mineral, el tensioactivo monoleato de maniuro y Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium butyricum destruido por calor.o sus extractos (para la agregación de macrófagos en el sitio de inoculación). Este potente adyuvante estimula la inmunidad humoral y mediada por células con inducción preferencial de anticuerpos contra epítopos de proteínas desnaturalizadas. Aunque el FCA ha sido históricamente el adyuvante más utilizado, es uno de los agentes más tóxicos debido al aceite mineral no metabolizable e induce reacciones granulomatosas. Su uso está limitado a animales de laboratorio y debe usarse solo con antígenos débiles. No debe usarse más de una vez en un solo animal, ya que múltiples inoculaciones de FCA pueden causar reacciones sistémicas graves y disminución de las respuestas inmunitarias. El adyuvante incompleto de Freund tiene la misma formulación que el FCA pero no contiene micobacterias ni sus componentes.La FIA generalmente se limita a dosis de refuerzo de antígeno, ya que normalmente es mucho menos eficaz que la FCA para la inducción de anticuerpos primarios. Los adyuvantes de Freund se mezclan normalmente con partes iguales de preparaciones de antígenos para formar emulsiones estables.

Sistema adyuvante Ribi

Los adyuvantes Ribi son emulsiones de aceite en agua donde los antígenos se mezclan con pequeños volúmenes de un aceite metabolizable (escualeno) que luego se emulsionan con solución salina que contiene el tensioactivo Polisorbato 80. Este sistema también contiene productos micobacterianos refinados (factor del cordón, esqueleto de la pared celular) como inmunoestimulantes y monofosforil lípido A bacteriano. Se encuentran disponibles tres formulaciones del sistema adyuvante orientadas a especies diferentes. Estos adyuvantes interactúan con las membranas de las células inmunitarias dando como resultado la inducción de citocinas, lo que mejora la captación, el procesamiento y la presentación de antígenos. Este sistema adyuvante es mucho menos tóxico y menos potente que el FCA, pero generalmente induce cantidades satisfactorias de anticuerpos de alta avidez contra los antígenos proteicos.

Titermax

Titermaxrepresenta una nueva generación de adyuvantes que son menos tóxicos y no contienen materiales de origen biológico. Se basa en mezclas de tensioactivos de acción lineal, bloques o cadenas de copolímeros no iónicos de polioxipropileno (POP) y polioxietileno (POE). Estos copolímeros son menos tóxicos que muchos otros materiales tensioactivos y tienen potentes propiedades adyuvantes que favorecen la quimiotaxis, la activación del complemento y la producción de anticuerpos. El adyuvante Titermax forma una emulsión microparticulada de agua en aceite con un copolímero y aceite de escualeno metabolizable. El copolímero está recubierto con partículas de sílice estabilizadoras de la emulsión que permiten la incorporación de grandes cantidades de una amplia variedad de materiales antigénicos. El copolímero activo adyuvante forma superficies hidrófilas, que activan el complemento,células inmunes y aumento de la expresión de las principales moléculas de histocompatibilidad de clase II en macrófagos. Titermax presenta antígeno en una forma altamente concentrada para el sistema inmunológico, lo que a menudo da como resultado títulos de anticuerpos comparables o superiores a los del FCA.

Specol : Specol es un adyuvante de agua en aceite hecho de aceite mineral purificado . Se ha informado que induce una respuesta inmune comparable al adyuvante de Freund en conejos y otros animales de investigación, mientras que produce menos lesiones histológicas.

Usos farmacéuticos

Digoxin Immune Fab es el fragmento de unión a antígeno de anticuerpos policlonales generados contra el derivado de Digitalis como un hapteno unido a una proteína y se usa para revertir la toxicidad de digoxina o digitoxina potencialmente mortal . ^{[1] [2] [3]}

La inmunoglobulina Rho (D) se elabora a partir de plasma humano combinado proporcionado por donantes Rh negativos con anticuerpos contra el antígeno D. Se utiliza para proporcionar una unión inmunitaria pasiva del antígeno, previniendo una respuesta inmunitaria activa materna que podría resultar en una enfermedad hemolítica del recién nacido . ^{[4] [5]}

Rozrolimupab es el anticuerpo policlonal humano recombinante anti- RhD compuesto por 25 anticuerpos IgG1 únicos y se utiliza para el tratamiento de la púrpura trombocitopénica inmunitaria y la prevención de la isoinmunización en mujeres embarazadas Rh negativas .

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ): tratamiento potencial para personas con COVID-19 y para prevenir la infección por coronavirus SARS-CoV-2 .

Ventajas

El uso de anticuerpos policlonales (PAb) sobre los anticuerpos monoclonales tiene sus ventajas. Las habilidades técnicas necesarias para producir anticuerpos policlonales no son tan exigentes. Son económicos de fabricar y se pueden generar con bastante rapidez, lo que demora varios meses en producirse. Los PAb son heterogéneos, lo que les permite unirse a una amplia gama de epítopos de antígenos. Debido a que los PAb se producen a partir de una gran cantidad de clones de células B, es más probable que se unan con éxito a un antígeno específico. Los PAb se mantienen estables en diferentes ambientes, como un cambio de pH o concentración de sal, lo que les permite ser más aplicables en determinados procedimientos. Además, dependiendo de la cantidad necesaria, los PAb se pueden preparar en grandes cantidades en relación con el tamaño del animal utilizado. ^{[6] [7] [8]}

Ver también

• Célula B plasmática
• Clon (biología de células B)
• Respuesta policlonal

Referencias

1. Digibind, DigiFab (FAB inmune a digoxina), efectos secundarios, interacciones e información sobre medicamentos en eMedicineHealth
2. Digibind® Digoxin Immune Fab (ovino)
3. https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm117624.pdf
4. Enfermedad hemolítica del recién nacido - Grupos sanguíneos y antígenos de glóbulos rojos , Biblioteca NCBI
5. La sangre donada por mujeres produce RhoGAM que salva vidas . USAToday.com
6. "Pasos críticos en la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales: evaluación y recomendaciones" . Revista ILAR . 46 .
7. Suckow, Mark A .; Stevens, Karla A .; Wilson, Ronald P. (2012). El laboratorio Conejo, conejillo de indias, hámster y otros roedores . Prensa académica. ISBN 978-0123809209.
8. "Anticuerpos monoclonales versus policlonales: características distintivas, aplicaciones y recursos de información" . Revista ILAR . 46 .

Enlaces externos

• Artículo de Nature News sobre la terapia con anticuerpos policlonales
• Medidas inmunológicas de antigenicidad (libro de texto en línea, consulte la sección 11.1).
• Anticuerpo policlonal en el diccionario de biología celular y molecular
• Generación de anticuerpos en openwetware (descripción técnica para investigadores)
• Anticuerpos policlonales vs monoclonales