Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas.

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas (normalmente abreviada como proteína NMR ) es un campo de la biología estructural en el que la espectroscopia de RMN se utiliza para obtener información sobre la estructura y dinámica de las proteínas , y también de los ácidos nucleicos y sus complejos. El campo fue iniciado por Richard R. Ernst y Kurt Wüthrich en la ETH , ^[1] y por Ad Bax , Marius Clore , Angela Gronenborn en el NIH , ^[2] y Gerhard Wagner en la Universidad de Harvard., entre otros. La determinación de la estructura por espectroscopia de RMN generalmente consta de varias fases, cada una de las cuales utiliza un conjunto separado de técnicas altamente especializadas. Se prepara la muestra, se realizan mediciones, se aplican enfoques interpretativos y se calcula y valida una estructura.

La RMN implica las propiedades mecánicas cuánticas del núcleo central (" núcleo ") del átomo. Estas propiedades dependen del entorno molecular local, y su medición proporciona un mapa de cómo los átomos están vinculados químicamente, qué tan cerca están en el espacio y qué tan rápido se mueven entre sí. Estas propiedades son fundamentalmente las mismas que se utilizan en las imágenes de resonancia magnética (MRI) más conocidas , pero las aplicaciones moleculares utilizan un enfoque algo diferente, apropiado para el cambio de escala de milímetros (de interés para los radiólogos) a nanómetros.(los átomos enlazados suelen estar separados por una fracción de nanómetro), un factor de un millón. Este cambio de escala requiere una sensibilidad de detección y estabilidad mucho mayor para la medición a largo plazo. A diferencia de la resonancia magnética, los estudios de biología estructural no generan directamente una imagen, sino que se basan en cálculos informáticos complejos para generar modelos moleculares tridimensionales.

Actualmente, la mayoría de las muestras se examinan en una solución en agua, pero se están desarrollando métodos para trabajar también con muestras sólidas . La recopilación de datos se basa en colocar la muestra dentro de un poderoso imán, enviar señales de radiofrecuencia a través de la muestra y medir la absorción de esas señales. Dependiendo del entorno de los átomos dentro de la proteína, los núcleos de los átomos individuales absorberán diferentes frecuencias de señales de radio. Además, las señales de absorción de diferentes núcleos pueden verse perturbadas por núcleos adyacentes. Esta información se puede utilizar para determinar la distancia entre núcleos. Estas distancias, a su vez, pueden usarse para determinar la estructura general de la proteína.

Un estudio típico podría involucrar cómo dos proteínas interactúan entre sí, posiblemente con el fin de desarrollar pequeñas moléculas que puedan usarse para probar la biología normal de la interacción (" biología química ") o para proporcionar posibles pistas para el uso farmacéutico ( desarrollo de fármacos ). Con frecuencia, el par de proteínas que interactúan puede haber sido identificado por estudios de genética humana, lo que indica que la interacción puede verse interrumpida por mutaciones desfavorables, o pueden desempeñar un papel clave en la biología normal de un organismo "modelo" como la mosca de la fruta, la levadura , el gusano C. elegans , o ratones. Para preparar una muestra, se suelen utilizar métodos de biología molecular para obtener cantidades mediante fermentación bacteriana . Esto también permite cambiar elcomposición isotópica de la molécula, que es deseable porque los isótopos se comportan de manera diferente y proporcionan métodos para identificar señales de RMN superpuestas.

Preparación de la muestra

La muestra de RMN se prepara en un tubo de vidrio de pared delgada .

La resonancia magnética nuclear de proteínas se realiza en muestras acuosas de proteína altamente purificada . Por lo general, la muestra consta de entre 300 y 600 microlitros con una concentración de proteína en el rango de 0,1 a 3 milimolar . La fuente de la proteína puede ser natural o producida en un sistema de producción utilizando técnicas de ADN recombinante mediante ingeniería genética . Las proteínas expresadas de forma recombinante suelen ser más fáciles de producir en cantidad suficiente y este método hace posible el marcaje isotópico .

La proteína purificada normalmente se disuelve en una solución tampón y se ajusta a las condiciones de disolvente deseadas. La muestra de RMN se prepara en un tubo de vidrio de pared delgada .

Recolección de datos

Protein NMR utiliza experimentos de resonancia magnética nuclear multidimensional para obtener información sobre la proteína. Idealmente, cada núcleo distinto de la molécula experimenta un entorno electrónico distinto y, por lo tanto, tiene un cambio químico distinto mediante el cual puede ser reconocido. Sin embargo, en moléculas grandes como las proteínas, el número de resonancias puede ser típicamente de varios miles y un espectro unidimensional inevitablemente tiene superposiciones incidentales. Por tanto, se realizan experimentos multidimensionales que correlacionan las frecuencias de distintos núcleos. Las dimensiones adicionales disminuyen la posibilidad de superposición y tienen un mayor contenido de información, ya que correlacionan las señales de los núcleos dentro de una parte específica de la molécula. La magnetización se transfiere a la muestra mediante pulsos electromagnéticos (radiofrecuencia ) energía y entre núcleos mediante retardos; el proceso se describe con las llamadas secuencias de pulsos . Las secuencias de pulsos permiten al experimentador investigar y seleccionar tipos específicos de conexiones entre núcleos. El conjunto de experimentos de resonancia magnética nuclear utilizados en proteínas se dividen en dos categorías principales: una en la que la magnetización se transfiere a través de enlaces químicos y otra en la que la transferencia se realiza a través del espacio, independientemente de la estructura de enlace. La primera categoría se usa para asignar los diferentes cambios químicos a un núcleo específico, y la segunda se usa principalmente para generar las restricciones de distancia utilizadas en el cálculo de la estructura y en la asignación con proteína no etiquetada.

Dependiendo de la concentración de la muestra, del campo magnético del espectrómetro y del tipo de experimento, un único experimento de resonancia magnética nuclear multidimensional en una muestra de proteína puede llevar horas o incluso varios días para obtener la relación señal-ruido adecuada. a través del promedio de la señal, y para permitir una evolución suficiente de la transferencia de magnetización a través de las diversas dimensiones del experimento. En igualdad de condiciones, los experimentos de dimensiones superiores tomarán más tiempo que los experimentos de dimensiones inferiores.

Normalmente, el primer experimento que se mide con una proteína marcada con isótopos es un espectro de correlación cuántica única heteronuclear 2D (HSQC), donde "heteronuclear" se refiere a núcleos distintos de 1H. En teoría, la correlación cuántica única heteronuclear tiene un pico por cada H unido a un heteronúcleo. Por lo tanto, en el 15N-HSQC, con una proteína marcada con 15 N , se espera una señal para cada átomo de nitrógeno en la columna vertebral , con la excepción de prolina., que no tiene amida-hidrógeno debido a la naturaleza cíclica de su columna vertebral. Cada residuo aporta señales adicionales de 15N-HSQC con un enlace nitrógeno-hidrógeno en su cadena lateral (W, N, Q, R, H, K). El 15N-HSQC a menudo se conoce como la huella dactilar de una proteína porque cada proteína tiene un patrón único de posiciones de señal. El análisis del 15N-HSQC permite a los investigadores evaluar si el número esperado de picos está presente y así identificar posibles problemas debido a conformaciones múltiples o heterogeneidad de la muestra. El experimento de correlación cuántica simple heteronuclear relativamente rápido ayuda a determinar la viabilidad de realizar experimentos posteriores más largos, más costosos y más elaborados. No es posible asignar picos a átomos específicos a partir de la correlación cuántica única heteronuclear sola.

Asignación de resonancia

Para analizar los datos de resonancia magnética nuclear, es importante obtener una asignación de resonancia para la proteína, es decir, averiguar qué desplazamiento químico corresponde a qué átomo. Esto se logra típicamente caminando secuencialmente usando información derivada de varios tipos diferentes de experimentos de RMN. El procedimiento exacto depende de si la proteína está marcada isotópicamente o no, ya que muchos de los experimentos de asignación dependen del carbono 13 y del nitrógeno 15.

Comparación de un espectro 2D COSY y TOCSY para un aminoácido como glutamato o metionina . El TOCSY muestra picos cruzados diagonales entre todos los protones en el espectro, pero el COSY solo tiene picos cruzados entre vecinos.

Resonancia magnética nuclear homonuclear

Con proteína sin marcar el procedimiento habitual es registrar un conjunto de experimentos de resonancia magnética nuclear homonuclear bidimensional mediante espectroscopia de correlación (COSY), de los cuales varios tipos incluyen espectroscopia de correlación convencional, espectroscopia de correlación total (TOCSY) y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) . ^{[3] [4]}Un experimento de resonancia magnética nuclear bidimensional produce un espectro bidimensional. Las unidades de ambos ejes son cambios químicos. El COSY y el TOCSY transfieren la magnetización a través de los enlaces químicos entre los protones adyacentes. El experimento de espectroscopía de correlación convencional solo puede transferir magnetización entre protones en átomos adyacentes, mientras que en el experimento de espectroscopía de correlación total los protones pueden transmitir la magnetización, por lo que se transfiere entre todos los protones que están conectados por átomos adyacentes. Por lo tanto, en una espectroscopia de correlación convencional, un protón alfa transfiere magnetización a los protones beta, los protones beta se transfieren a los protones alfa y gamma, si los hay, luego el protón gamma se transfiere a los protones beta y delta, y el proceso continúa. .En la espectroscopia de correlación total, el alfa y todos los demás protones pueden transferir magnetización a beta, gamma, delta, épsilon si están conectados por una cadena continua de protones. La cadena continua de protones es la cadena lateral del individuo.aminoácidos . Por lo tanto, estos dos experimentos se utilizan para construir los llamados sistemas de espín, es decir, construir una lista de resonancias del desplazamiento químico del protón del péptido, los protones alfa y todos los protones de cada residuo.cadena lateral. Qué cambios químicos corresponden a qué núcleos en el sistema de espín está determinado por las conectividades de la espectroscopia de correlación convencional y el hecho de que los diferentes tipos de protones tienen cambios químicos característicos. Para conectar los diferentes spinsystems en un orden secuencial, se debe utilizar el experimento de espectroscopía de efecto Overhauser nuclear. Debido a que este experimento transfiere magnetización a través del espacio, mostrará picos cruzados para todos los protones que están cerca en el espacio, independientemente de si están en el mismo sistema de espín o no. Los residuos vecinos están intrínsecamente cerca en el espacio, por lo que las asignaciones pueden ser realizadas por los picos en NOESY con otros sistemas de espín.

Un problema importante al utilizar la resonancia magnética nuclear homonuclear es la superposición entre picos. Esto ocurre cuando diferentes protones tienen cambios químicos iguales o muy similares. Este problema se agrava a medida que la proteína se hace más grande, por lo que la resonancia magnética nuclear homonuclear suele estar restringida a pequeñas proteínas o péptidos.

Resonancia magnética nuclear de nitrógeno 15

Artículo principal: espectroscopia de coherencia cuántica única heteronuclear

El experimento 15N que se realiza con más frecuencia es el HSQC ¹ H- ¹⁵ N. El experimento es muy sensible y, por lo tanto, se puede realizar con relativa rapidez. A menudo se utiliza para comprobar la idoneidad de una proteína para la determinación de la estructura mediante RMN, así como para la optimización de las condiciones de la muestra. Es uno de los experimentos estándar utilizados para la determinación de la estructura de la solución de una proteína. El HSQC se puede expandir aún más en experimentos de RMN tridimensionales y cuatridimensionales, como ¹⁵ N-TOCSY-HSQC y ¹⁵ N-NOESY-HSQC. ^[5]

Esquema de un HNCA y HNCOCA para cuatro residuos secuenciales. La dimensión de nitrógeno 15 es perpendicular a la pantalla. Cada ventana se centra en el cambio químico de nitrógeno de ese aminoácido. La asignación secuencial se realiza haciendo coincidir los cambios químicos del carbono alfa. En el HNCA, cada residuo ve el carbono alfa de sí mismo y el residuo anterior. El HNCOCA solo ve el carbono alfa del residuo anterior.

Resonancia magnética nuclear de carbono 13 y nitrógeno 15

Artículo principal: espectroscopia de resonancia magnética nuclear de triple resonancia

Cuando la proteína se marca con carbono-13 y nitrógeno-15, es posible registrar experimentos de triple resonancia que transfieren la magnetización sobre el enlace peptídico y, por lo tanto, conectan diferentes sistemas de espín a través de enlaces. ^{[6] [7]} Esto generalmente se hace usando algunos de los siguientes experimentos, HNCO , HN (CA) CO , HNCA , ^[8] HN (CO) CA , HNCACB y CBCA (CO) NH . Los seis experimentos consisten en un plano ¹ H- ¹⁵ N (similar a un espectro HSQC) expandido con una dimensión de carbono. En el HN (CA) CO, cada H _NEl plano contiene los picos del carbono carbonilo de su residuo, así como el anterior en la secuencia. El HNCO contiene el desplazamiento químico del carbono carbonilo solo del residuo anterior, pero es mucho más sensible que el HN (CA) CO. Estos experimentos permiten que cada pico de ¹ H- ¹⁵ N se vincule al carbono carbonilo precedente, y la asignación secuencial se puede realizar haciendo coincidir los cambios de los carbonos propios y anteriores de cada sistema de espín. El HNCA y el HN (CO) CA funcionan de manera similar, solo con los carbonos alfa (C _α ) en lugar de los carbonilos, y el HNCACB y el CBCA (CO) NH contienen tanto el carbono alfa como el carbono beta (C _β). Por lo general, se requieren varios de estos experimentos para resolver la superposición en la dimensión del carbono. Este procedimiento suele ser menos ambiguo que el método basado en NOESY, ya que se basa en la transferencia mediante enlace. En los métodos basados ​​en NOESY, aparecerán picos adicionales correspondientes a átomos que están cerca en el espacio pero que no pertenecen a residuos secuenciales, confundiendo el proceso de asignación. Después de la asignación de resonancia secuencial inicial, generalmente es posible extender la asignación de C _α y C _β al resto de la cadena lateral utilizando experimentos como HCCH-TOCSY, que es básicamente un experimento TOCSY resuelto en una dimensión de carbono adicional.

Generación de moderación

Para realizar cálculos de estructura, es necesario generar una serie de restricciones determinadas experimentalmente. Estos se dividen en diferentes categorías; los más utilizados son las restricciones de distancia y las restricciones de ángulo.

Restricciones de distancia

Un pico cruzado en un experimento NOESY significa proximidad espacial entre los dos núcleos en cuestión. Por tanto, cada pico se puede convertir en una distancia máxima entre los núcleos, normalmente entre 1,8 y 6 angstroms . La intensidad de un pico NOESY es proporcional a la distancia a la menos sexta potencia, por lo que la distancia se determina de acuerdo con la intensidad del pico. La relación intensidad-distancia no es exacta, por lo que normalmente se utiliza un rango de distancia.

Es de gran importancia asignar los picos NOESY a los núcleos correctos en función de los cambios químicos. Si esta tarea se realiza manualmente, suele ser muy laboriosa, ya que las proteínas suelen tener miles de picos NOESY. Algunos programas informáticos como PASD ^{[9] [10]} / XPLOR-NIH , ^{[11] [12]} UNIO , ^[13] CYANA , ^[14] ARIA ^[15] / CNS , ^[16] y AUDANA ^[17] / PONDEROSA -C / S ^[18] en la plataforma Integrative NMR ^[19]Realice esta tarea automáticamente en listados preprocesados ​​manualmente de posiciones pico y volúmenes pico, junto con un cálculo de estructura. El acceso directo a los datos NOESY sin procesar sin la engorrosa necesidad de listas de picos refinadas iterativamente hasta ahora solo se otorga mediante el algoritmo PASD ^[10] implementado en XPLOR-NIH , ^[11] el enfoque ATNOS / CANDID implementado en el paquete de software UNIO, ^{[ 13]} y el PONDEROSA-C / S y, por lo tanto, garantiza un análisis espectral NOESY objetivo y eficiente.

Para obtener asignaciones lo más precisas posible, es una gran ventaja tener acceso a los experimentos NOESY de carbono 13 y nitrógeno 15, ya que ayudan a resolver el solapamiento en la dimensión del protón. Esto conduce a asignaciones más rápidas y confiables y, a su vez, a mejores estructuras.

Restricciones de ángulo

Además de las restricciones de distancia , se pueden generar restricciones en los ángulos de torsión de los enlaces químicos, típicamente los ángulos psi y phi . Un enfoque consiste en utilizar la ecuación de Karplus para generar restricciones de ángulo a partir de constantes de acoplamiento . Otro enfoque utiliza los cambios químicos para generar restricciones de ángulo. Ambos métodos utilizan el hecho de que la geometría alrededor del carbono alfa afecta las constantes de acoplamiento y los cambios químicos, por lo que dadas las constantes de acoplamiento o los cambios químicos, se puede hacer una conjetura calificada sobre los ángulos de torsión.

Restricciones de orientación

Artículo principal: acoplamiento dipolar residual

Las flechas azules representan la orientación del enlace N - H de los enlaces peptídicos seleccionados. Al determinar la orientación de una cantidad suficiente de enlaces con respecto al campo magnético externo, se puede determinar la estructura de la proteína. Desde el registro PDB 1KBH

Las moléculas de analito en una muestra se pueden ordenar parcialmente con respecto al campo magnético externo del espectrómetro manipulando las condiciones de la muestra. Las técnicas comunes incluyen la adición de bacteriófagos o bicelas a la muestra, o la preparación de la muestra en un gel de poliacrilamida estirado . Esto crea un entorno local que favorece determinadas orientaciones de moléculas no esféricas. Normalmente, en la RMN en solución, los acoplamientos dipolares entre núcleos se promedian debido al rápido giro de la molécula. La ligera superpoblación de una orientación significa que queda por observar un acoplamiento dipolar residual . El acoplamiento dipolar se usa comúnmente en RMN de estado sólidoy proporciona información sobre la orientación relativa de los vectores de enlace con respecto a un único marco de referencia global. Normalmente, la orientación del vector NH se prueba en un experimento similar a HSQC. Inicialmente, los acoplamientos dipolares residuales se utilizaron para el refinamiento de estructuras previamente determinadas, pero también se han realizado intentos de determinación de la estructura de novo. ^[20]

Intercambio de hidrógeno-deuterio

Artículo principal: Intercambio de hidrógeno-deuterio

La espectroscopia de RMN es específica del núcleo. Por tanto, puede distinguir entre hidrógeno y deuterio. Los protones de amida en la proteína se intercambian fácilmente con el disolvente y, si el disolvente contiene un isótopo diferente, típicamente deuterio , la reacción puede controlarse mediante espectroscopía de RMN. La rapidez con que una amida determinada se intercambia refleja su accesibilidad a los disolventes. Por lo tanto, los tipos de cambio de amida pueden proporcionar información sobre qué partes de la proteína están enterradas, unidas por enlaces de hidrógeno, etc. Una aplicación común es comparar el intercambio de una forma libre con un complejo. Se supone que las amidas que quedan protegidas en el complejo están en la interfaz de interacción.

Cálculo de estructura

La determinación de la estructura por resonancia magnética nuclear genera un conjunto de estructuras. Las estructuras convergerán solo si los datos son suficientes para dictar un pliegue específico. En estas estructuras, es el caso de solo una parte de la estructura. De la entrada 1SSU de la PDB .

Las restricciones determinadas experimentalmente se pueden utilizar como entrada para el proceso de cálculo de la estructura. Los investigadores, utilizando programas informáticos como XPLOR-NIH , ^[11] CYANA o GeNMR, intentan satisfacer la mayor cantidad posible de restricciones, además de las propiedades generales de las proteínas, como la longitud y los ángulos de los enlaces. Los algoritmos convierten las restricciones y las propiedades generales de las proteínas en términos de energía y luego tratan de minimizar esta energía. El proceso da como resultado un conjunto de estructuras que, si los datos fueran suficientes para dictar un cierto pliegue, convergerían.

Validación de estructura

Es importante señalar que el conjunto de estructuras obtenido es un "modelo experimental", es decir, una representación de cierto tipo de datos experimentales. Reconocer este hecho es realmente importante porque significa que el modelo podría ser una buena o mala representación de esos datos experimentales. ^[21] En general, la calidad de un modelo dependerá tanto de la cantidad como de la calidad de los datos experimentales utilizados para generarlo y de la interpretación correcta de dichos datos.

Es importante recordar que todos los experimentos tienen errores asociados. Los errores aleatorios afectarán la reproducibilidad y precisión de las estructuras resultantes. Si los errores son sistemáticos, la precisión del modelo se verá afectada. La precisión indica el grado de reproducibilidad de la medición y, a menudo, se expresa como la varianza del conjunto de datos medidos en las mismas condiciones. Sin embargo, la precisión indica el grado en que una medición se acerca a su valor "verdadero".

Idealmente, un modelo de una proteína será más preciso cuanto más se ajuste a la molécula real que representa y será más preciso ya que hay menos incertidumbre sobre las posiciones de sus átomos. En la práctica, no existe una "molécula estándar" con la que comparar modelos de proteínas, por lo que la precisión de un modelo viene dada por el grado de concordancia entre el modelo y un conjunto de datos experimentales. Históricamente, las estructuras determinadas por RMN han sido, en general, de menor calidad que las determinadas por difracción de rayos X. Esto se debe, en parte, a la menor cantidad de información contenida en los datos obtenidos por RMN. Debido a este hecho, se ha convertido en una práctica común establecer la calidad de los conjuntos de RMN comparándolos con la conformación única determinada por difracción de rayos X para la misma proteína. Sin embargo,la estructura de difracción de rayos X puede no existir y, dado que las proteínas en solución son moléculas flexibles, una proteína representada por una sola estructura puede llevar a subestimar la variación intrínseca de las posiciones atómicas de una proteína. Un conjunto de conformaciones, determinadas por RMN o cristalografía de rayos X, puede ser una mejor representación de los datos experimentales de una proteína que una conformación única.^[22]

La utilidad de un modelo vendrá dada, al menos en parte, por el grado de exactitud y precisión del modelo. Un modelo exacto con una precisión relativamente pobre podría ser útil para estudiar las relaciones evolutivas entre las estructuras de un conjunto de proteínas, mientras que el diseño racional de un fármaco requiere modelos precisos y exactos. Un modelo que no sea exacto, independientemente del grado de precisión con el que se haya obtenido, no será de mucha utilidad. ^{[21] [23]}

Dado que las estructuras de proteínas son modelos experimentales que pueden contener errores, es muy importante poder detectar estos errores. El proceso destinado a la detección de errores se conoce como validación. Existen varios métodos para validar estructuras, algunos son estadísticos como PROCHECK y WHAT IF, mientras que otros se basan en principios físicos como CheShift , o una mezcla de principios estadísticos y físicos PSVS .

Dinámica

Ver también: dinámica de proteínas

Además de las estructuras, la resonancia magnética nuclear puede proporcionar información sobre la dinámica de varias partes de la proteína . Por lo general, esto implica medir tiempos de relajación como T ₁ y T ₂ para determinar los parámetros de orden, los tiempos de correlación y las tasas de intercambio químico. La relajación de la RMN es una consecuencia de los campos magnéticos fluctuantes locales dentro de una molécula. Los campos magnéticos fluctuantes locales son generados por movimientos moleculares. De esta manera, las mediciones de los tiempos de relajación pueden proporcionar información sobre los movimientos dentro de una molécula a nivel atómico. En estudios de RMN de la dinámica de las proteínas, el nitrógeno-15El isótopo es el núcleo preferido para estudiar porque sus tiempos de relajación son relativamente sencillos de relacionar con los movimientos moleculares. Sin embargo, esto requiere el marcaje isotópico de la proteína. Los tiempos de relajación T ₁ y T ₂ se pueden medir utilizando varios tipos de HSQCExperimentos basados ​​en Los tipos de movimientos que se pueden detectar son movimientos que ocurren en una escala de tiempo que va desde aproximadamente 10 picosegundos hasta aproximadamente 10 nanosegundos. Además, también se pueden estudiar los movimientos más lentos, que tienen lugar en una escala de tiempo que varía de aproximadamente 10 microsegundos a 100 milisegundos. Sin embargo, dado que los átomos de nitrógeno se encuentran principalmente en la columna vertebral de una proteína, los resultados reflejan principalmente los movimientos de la columna vertebral, que es la parte más rígida de una molécula de proteína. Por tanto, los resultados obtenidos de las mediciones de relajación del nitrógeno 15 pueden no ser representativos de la proteína completa. Por lo tanto, las técnicas que utilizan mediciones de relajación de carbono-13 y deuterioSe han desarrollado recientemente, lo que permite estudios sistemáticos de los movimientos de las cadenas laterales de aminoácidos en las proteínas. Un caso de estudio desafiante y especial con respecto a la dinámica y flexibilidad de péptidos y proteínas de longitud completa está representado por estructuras desordenadas. Hoy en día, es un concepto aceptado que las proteínas pueden exhibir un comportamiento más flexible conocido como desorden o falta de estructura; sin embargo, es posible describir un conjunto de estructuras en lugar de una imagen estática que representa un estado completamente funcional de la proteína. Muchos avances están representados en este campo, en particular en términos de nuevas secuencias de pulsos, mejora tecnológica y formación rigurosa de investigadores en el campo.

Espectroscopia de RMN en proteínas grandes

Tradicionalmente, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear se ha limitado a proteínas o dominios de proteínas relativamente pequeños. Esto se debe en parte a problemas para resolver picos superpuestos en proteínas más grandes, pero esto se ha aliviado con la introducción de marcaje de isótopos y experimentos multidimensionales. Otro problema más grave es el hecho de que en las proteínas grandes la magnetización se relaja más rápido, lo que significa que hay menos tiempo para detectar la señal. Esto, a su vez, hace que los picos se vuelvan más amplios y más débiles y, finalmente, desaparezcan. Se han introducido dos técnicas para atenuar la relajación: espectroscopia optimizada de relajación transversal (TROSY) ^[24] y deuteración ^[25]de proteínas. Mediante el uso de estas técnicas ha sido posible estudiar proteínas en complejo con la chaperona de 900 kDa GroES - GroEL . ^[26]

Automatización del proceso

La determinación de la estructura por RMN ha sido tradicionalmente un proceso que lleva mucho tiempo, que requiere un análisis interactivo de los datos por parte de un científico altamente capacitado. Ha habido un interés considerable en automatizar el proceso para aumentar el rendimiento de la determinación de la estructura y hacer que la RMN de proteínas sea accesible para los no expertos (ver genómica estructural). Los dos procesos involucrados que consumen más tiempo son la asignación de resonancia específica de secuencia (asignación de backbone y de cadena lateral) y las tareas de asignación de NOE. Se han publicado varios programas informáticos diferentes que se dirigen a partes individuales del proceso general de determinación de la estructura de RMN de forma automatizada. La mayor parte del progreso se ha logrado para la tarea de asignación automatizada de NOE. Hasta ahora, solo se propuso el enfoque FLYA y UNIO para realizar todo el proceso de determinación de la estructura de RMN de la proteína de manera automatizada sin ninguna intervención humana. ^{[13] [14]} Recientemente, módulos en NMRFAM-SPARKY como APES (código de dos letras: ae), I-PINE / PINE-SPARKY (código de dos letras: ep; servidor web I-PINE) y PONDEROSA (código de dos letras: c3, up; servidor web PONDEROSA ) están integrados para ofrecer una automatización completa con capacidad de verificación visual en cada paso. ^[27] También se han realizado esfuerzos para estandarizar el protocolo de cálculo de la estructura para hacerlo más rápido y más fácil de automatizar. ^[28]

Ver también

• Espectroscopia de RMN
• Resonancia magnética nuclear
• Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbohidratos.
• Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de ácidos nucleicos.
• Cristalización de proteínas
• Dinámica proteica
• Relajación (RMN)
• Cristalografía de rayos X

Referencias

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Lectura adicional

• T. Kevin Hitchens; Gordon S. Rule (2005). Fundamentos de la espectroscopia de RMN de proteínas (enfoque en biología estructural) . Berlín: Springer. ISBN 978-1-4020-3499-2.
• Quincy Teng (2005). Biología estructural: aplicaciones prácticas de RMN . Berlín: Springer. Bibcode : 2005stbi.book ..... T . ISBN 978-0-387-24367-2.
• Mark Rance; Cavanagh, John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton, NNicholas J. (2007). Espectroscopia de RMN de proteínas: principios y práctica (2ª ed.). Boston: Prensa académica. ISBN 978-0-12-164491-8.
• Kurt Wüthrich (1986). RMN de proteínas y ácidos nucleicos . Nueva York: Wiley. ISBN 978-0-471-82893-8.

Enlaces externos

Recursos de la biblioteca sobre espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas

Recursos en su biblioteca Recursos en otras bibliotecas

• Estrategia basada en NOESY para asignaciones de resonancias de cadena lateral y columna vertebral de proteínas grandes sin deuteración (un protocolo)
• relax Software para el análisis de la dinámica de RMN
• ProSA-web Archivado el 11 de mayo de 2011 en el servicio web Wayback Machine para el reconocimiento de errores en estructuras de proteínas determinadas experimental o teóricamente
• Determinación de la estructura de la proteína a partir de datos experimentales escasos : una presentación introductoria
• RMN de proteína Experimentos de RMN de proteína