Un dot blot (o slot blot ) es una técnica en biología molecular utilizada para detectar proteínas. Representa una simplificación del método de transferencia Western , con la excepción de que las proteínas a detectar no se separan primero por electroforesis . En cambio, la muestra se aplica directamente sobre una membrana en un solo lugar y se realiza el procedimiento de transferencia.
La técnica ofrece importantes ahorros de tiempo, ya que no se requieren cromatografía o electroforesis en gel y los complejos procedimientos de transferencia del gel. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la proteína objetivo. [1]
Usos
Realizar un dot blot es similar en idea a realizar un western blot, con la ventaja de una mayor velocidad y menor costo.
También se realizan transferencias de puntos para seleccionar las capacidades de unión de un anticuerpo. [2]
Métodos
Un protocolo general de transferencia de puntos implica colocar 1 o 2 microlitros de una muestra en una membrana de nitrocelulosa o PVDF y dejar que se seque al aire. Las muestras pueden estar en forma de sobrenadantes de cultivo de tejidos, suero sanguíneo, extractos de células u otras preparaciones. [3]
La membrana se incuba en tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica. Luego se incuba con un anticuerpo primario seguido de un anticuerpo de detección o un anticuerpo primario conjugado con una molécula de detección (comúnmente HRP o fosfatasa alcalina ). Después de la unión del anticuerpo, la membrana se incuba con un sustrato quimioluminiscente y se obtienen imágenes.
Aparato
La transferencia por puntos se realiza convencionalmente en un trozo de membrana de nitrocelulosa o membrana de PVDF. Después de que las muestras de proteína se colocan sobre la membrana, la membrana se coloca en un recipiente de plástico y se incuba secuencialmente en tampón de bloqueo, soluciones de anticuerpos o tampón de enjuague en un agitador. Finalmente, para obtener imágenes de quimioluminiscencia, la pieza de membrana debe envolverse en una película de plástico transparente llena de sustrato enzimático.
Se ha utilizado un aparato de transferencia de puntos asistido por vacío para facilitar el proceso de enjuague e incubación mediante el uso de vacío para extraer la solución de debajo de la membrana, que se ensambla entre varias capas de placas para garantizar un buen sellado entre los pocillos de muestra, retener la solución de desecho y entregar fuerza de succión. Para la detección de señales de quimioluminiscencia, es necesario desmontar el aparato y sacar la membrana y envolverla en una película de plástico transparente.
Ver también
Referencias
- ^ "Prueba Blots, Slot Blots y Dot Blots - Inmunodetección | Bio-Rad" . Bio-Rad .
- ^ Rupprecht, Kevin R .; Nair, Rad K .; Harwick, Larissa C .; Grote, Jonathan; Beligere, Gangamani S .; Rege, Sushil D .; Chen, Yon-Yih; Lin, Zhen; Fishpaugh, Jeffrey R. (15 de diciembre de 2010). "Desarrollo de un ensayo dot-blot para el cribado de anticuerpos monoclonales frente a fármacos de baja masa molecular". Bioquímica analítica : 160-164. doi : 10.1016 / j.ab.2010.08.003 . PMID 20696124 .
- ^ "Protocolo Dot Blot" (PDF) .