La transfección inversa es una técnica para la transferencia de material genético a las células . Como el ADN se imprime en un portaobjetos de vidrio para que el proceso de transfección (la introducción deliberada de ácidos nucleicos en las células) ocurra antes de la adición de células adherentes, el orden de adición de ADN y células adherentes es inverso al de la transfección convencional . [1] Por lo tanto, se usa la palabra "reverso".
Proceso
Preparación de la mezcla de transfección para la impresión de portaobjetos
Puede usarse una mezcla de ADN- gelatina para imprimir en un portaobjetos. El polvo de gelatina se disuelve primero en agua Milli-Q estéril para formar una solución de gelatina al 0,2%. A continuación, se mezcla el plásmido de ADN purificado con la solución de gelatina y la concentración final de gelatina se mantiene por encima del 0,17%. Además de la gelatina, el atelocolágeno y la fibronetina también son vectores de transfección exitosos para introducir ADN extraño en el núcleo celular.
Impresión de portaobjetos de mezcla de gelatina y ADN
Después de la preparación de la mezcla de gelatina y ADN, la mezcla se pipetea sobre una superficie de portaobjetos y el portaobjetos se coloca en una placa de Petri cubierta . Se agrega un desecante al plato para secar la solución. Finalmente, las células cultivadas se vierten en la placa para la absorción del plásmido. Sin embargo, con la invención de diferentes tipos de sistemas de impresión de micromatrices, se pueden imprimir cientos de mezclas de transfección (que contienen diferentes ADN de interés) en el mismo portaobjetos para la absorción celular de plásmidos. [2] Hay dos tipos principales de sistemas de impresión de microarrays fabricados por diferentes empresas: sistemas de impresión de contacto y sin contacto.
Un ejemplo de un sistema de impresión sin contacto es el sistema de micromatrices flexible sin contacto de Piezorray. Utiliza control de presión y un collar piezoeléctrico para exprimir gotas consistentes de aproximadamente 333 pL de volumen. Los dispensadores PiezoTip no entran en contacto con la superficie a la que se dispensa la muestra; por lo tanto, se reduce el potencial de contaminación y se elimina el riesgo de alterar la superficie objetivo. Un ejemplo de un sistema de impresión por contacto es el sistema de localización por contacto SpotArray 72 (Perkin Elmer Life Sciences). Su cabezal de impresión puede acomodar hasta 48 pines y crea matrices compactas al subir y bajar selectivamente subconjuntos de pines durante la impresión. Después de la impresión, los pines se lavan con una potente arandela de chorro a presión y se secan al vacío, eliminando el arrastre. Otro ejemplo de un sistema de impresión por contacto es el sistema Qarray (Genetix). Tiene tres tipos de sistemas de impresión: QArray Mini, QArray 2 y QArray Max. Después de la impresión, se deja secar la solución y la gelatina de ADN se pega firmemente en su posición en la matriz.
HybriWell en transfección inversa
Primero, el adhesivo del HybriWell se despega y el HybriWell se coloca sobre el área del portaobjetos impresa con la solución de gelatina-ADN. En segundo lugar, se pipetean 200 ul de mezcla de transfección en uno de los puertos HybriWell; la mezcla se distribuirá uniformemente sobre la matriz. Luego, la matriz se incuba, con la temperatura y el tiempo dependiendo de los tipos de células utilizados. En tercer lugar, la mezcla de transfección se pipetea y el HybriWell se retira con unas pinzas de punta fina . En cuarto lugar, el portaobjetos impreso tratado con reactivo de transfección se coloca en un plato cuadrado con el lado impreso hacia arriba. En quinto lugar, las células recolectadas se vierten suavemente sobre los portaobjetos (no sobre las áreas impresas). Finalmente, la placa se coloca en una incubadora humidificada con CO 2 al 5% a 37 ° C y se incuba durante la noche.
Otros reactivos de transfección inversa
El reactivo Effectene se usa junto con el potenciador y el tampón de condensación de ADN (Buffer EC) para lograr una alta eficiencia de transfección. En el primer paso de la formación del complejo Effectene-ADN , el ADN se condensa por interacción con el potenciador en un sistema de tampón definido. A continuación, se añade el reactivo Effectene al ADN condensado para producir complejos condensados Effectene-ADN. Los complejos Effectene-DNA se mezclan con el medio y se agregan directamente a las células. El reactivo Effectene forma espontáneamente estructuras de micelas que no presentan variación de tamaño o lote (como se puede encontrar con los reactivos de liposomas pre-formulados). Esta característica asegura la reproducibilidad de la formación del complejo de transfección. El proceso de alta condensación de moléculas de ADN y luego recubrirlas con Effectene Reagent es una forma efectiva de transferir ADN a células eucariotas .
Ventajas y desventajas
Las ventajas de la transfección inversa (sobre la transfección convencional) son:
- La adición y unión de células diana a la superficie cargada de ADN puede conducir a una mayor probabilidad de contacto entre la célula y el ADN, lo que podría conducir a una mayor eficiencia de transfección. [3]
- Materiales que ahorran mano de obra (se requiere menos ADN)
- Proyección de alto impacto; cientos de genes pueden expresarse en células en un solo microarreglo para estudiar la expresión y regulación de genes . [4]
- La siembra de células paralelas en una sola cámara para 384 experimentos, sin separación física entre experimentos, aumenta la calidad de los datos de detección . Las variaciones de pozo a pozo ocurren en experimentos realizados en platos de paredes múltiples.
- Se pueden producir matrices de réplicas exactas, ya que la misma placa fuente de muestra puede secarse e imprimirse en diferentes portaobjetos durante al menos 15 meses de almacenamiento sin pérdida aparente de la eficacia de la transfección.
Las desventajas de la transfección inversa son:
- La transfección inversa es más cara porque se necesita un sistema de impresión de micromatrices de alta precisión y eficacia para imprimir la solución de gelatina de ADN en los portaobjetos.
- Las aplicaciones con diferentes líneas celulares han requerido (hasta ahora) variaciones de protocolo para fabricar siRNA o matrices de plásmidos, lo que implica un desarrollo y pruebas considerables.
- Mayor posibilidad de contaminación cruzada de los puntos de la matriz a medida que aumenta la densidad del punto; por lo tanto, la optimización del diseño de la matriz es importante. [5]
Referencias
- ^ "Transfección inversa" . Consultado el 24 de agosto de 2018 .
- ^ Página de inicio de transfección inversa obtenido el 14 de octubre de 2011.
- ^ Erfle, H. et al. (2007), "Transfección inversa en matrices de células para cribado de alto contenido ". Microscopía, protocolo Nat 2 , 392–399
- ^ Neumann B et al., "Detección de ARNi de alto rendimiento medianteimágenes de lapso de tiempo de células humanas vivas ". Nat Methods 3, 385–390 (2006).
- ^ Líneas de células cancerosas y células primarias. Consultado el 14 de octubre de 2011.