La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos desnudos o purificados en células eucariotas . [1] [2] También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque a menudo se prefieren otros términos: " transformación " se usa típicamente para describir la transferencia de ADN no viral en bacterias y células eucariotas no animales , incluidas las células vegetales. En células animales, transfección es el término preferido ya que transformación también se usa para referirse a la progresión a un estado canceroso ( carcinogénesis ) en estas células. Transducciónse utiliza a menudo para describir la transferencia de genes mediada por virus a células eucariotas. [2] [3]
La palabra transfección es un acrónimo de trans e infección . Se puede transfectar material genético (como ADN plasmídico superenrollado o construcciones de ARNip ), o incluso proteínas como anticuerpos .
La transfección de células animales normalmente implica la apertura de poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular para permitir la absorción de material. La transfección se puede realizar utilizando fosfato cálcico (es decir, fosfato tricálcico ), por electroporación , exprimiendo las células o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.
La transfección puede resultar en morfologías inesperadas y anomalías en las células diana.
Terminología
El significado del término ha evolucionado. [4] El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir, introducción de material genético, ADN o ARN, de un virus o bacteriófago que infecta a procariotas en las células, lo que da como resultado una infección. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología de células animales (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de cambio en la célula. propiedades causadas por la introducción de ADN.
Métodos
Existen varios métodos para introducir ADN extraño en una célula eucariota : algunos se basan en el tratamiento físico (electroporación, exprimido celular, nanopartículas, magnetofección); otros dependen de materiales químicos o partículas biológicas (virus) que se utilizan como portadores. La entrega de genes es, por ejemplo, uno de los pasos necesarios para la terapia génica y la modificación genética de cultivos. Hay muchos métodos diferentes de administración de genes desarrollados para varios tipos de células y tejidos, desde bacterianos hasta mamíferos. Generalmente, los métodos se pueden dividir en dos categorías: no virales y virales. [5]
Los métodos no virales incluyen métodos físicos como electroporación , microinyección , pistola de genes , impalefección , presión hidrostática , infusión continua y sonicación y productos químicos, como lipofección , que es un proceso de transfección de ADN mediado por lípidos que utiliza vectores liposómicos. También puede incluir el uso de portadores de genes poliméricos (polyplexes). [6]
La entrega de genes mediada por virus utiliza la capacidad de un virus para inyectar su ADN dentro de una célula huésped. Un gen destinado a la administración se empaqueta en una partícula viral de replicación deficiente. Los virus utilizados hasta la fecha incluyen retrovirus , lentivirus , adenovirus , virus adenoasociados y virus del herpes simple . Sin embargo, existen inconvenientes en el uso de virus para introducir genes en las células. Los virus solo pueden introducir fragmentos muy pequeños de ADN en las células, requiere mucha mano de obra y existen riesgos de sitios de inserción aleatorios, efectos citopáticos y mutagénesis.
Los esferoplastos bacterianos pueden transfectar células animales.
Métodos no virales
Transfección de base química
La transfección química se puede dividir en varios tipos: ciclodextrina , [7] polímeros, [8] liposomas o nanopartículas [9] (con o sin funcionalización química o viral. Ver más abajo).
- Uno de los métodos más baratos es el fosfato cálcico , descubierto originalmente por FL Graham y AJ van der Eb en 1973 [10] (véase también [11] ). La solución salina tamponada con HEPES (HeBS) que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el ADN que se va a transfectar. Cuando los dos se combinan, se formará un fino precipitado de calcio cargado positivamente y fosfato cargado negativamente, que unirá el ADN que se transfectará en su superficie. A continuación, se añade la suspensión del precipitado a las células que se van a transfectar (normalmente un cultivo celular desarrollado en una monocapa). Mediante un proceso que no se comprende del todo, las células absorben parte del precipitado y, con él, el ADN. Este proceso ha sido un método preferido para identificar muchos oncogenes. [12]
- Otro método es el uso de polímeros catiónicos como DEAE-dextrano o polietilenimina (PEI). El ADN cargado negativamente se une al policatión y la célula absorbe el complejo mediante endocitosis .
- La lipofección (o transfección de liposomas ) es una técnica que se utiliza para inyectar material genético en una célula mediante liposomas , que son vesículas que pueden fusionarse fácilmente con la membrana celular ya que ambas están formadas por una bicapa de fosfolípidos . [13] La lipofección generalmente usa un lípido cargado positivamente ( catiónico ) ( liposomas catiónicos o mezclas) para formar un agregado con el material genético cargado negativamente ( aniónico ). [14] Esta tecnología de transfección realiza las mismas tareas que otros procedimientos bioquímicos que utilizan polímeros, DEAE-dextrano , fosfato de calcio y electroporación . La eficacia de la lipofección se puede mejorar tratando las células transfectadas con un choque térmico leve . [15]
- Fugene es una serie de reactivos de transfección no liposomal patentados ampliamente utilizados capaces de transfectar directamente una amplia variedad de células con alta eficiencia y baja toxicidad. [16] [17] [18] [19]
- El dendrímero es una clase de moléculas altamente ramificadas basadas en varios componentes básicos y sintetizadas mediante un método convergente o divergente. Estos dendrímeros se unen a los ácidos nucleicos para formar dendriplex que luego penetran en las células. [20] [21]
Métodos no químicos
- La electroporación ( electrotransferencia de genes ) es un método popular, en el que se logra un aumento transitorio de la permeabilidad de la membrana celular cuando las células se exponen a pulsos cortos de un campo eléctrico intenso.
- La compresión celular es un método inventado en 2012 por Armon Sharei, Robert Langer y Klavs Jensen en el MIT. Permite la entrega de moléculas a las células a través de la deformación de la membrana celular. Es una plataforma de microfluidos sin vectores de alto rendimiento para la administración intracelular. Reduce la posibilidad de toxicidad o efectos fuera del objetivo, ya que no depende de materiales exógenos o campos eléctricos. [22]
- La sonoporación utiliza ultrasonidos de alta intensidad para inducir la formación de poros en las membranas celulares. Esta formación de poros se atribuye principalmente a la cavitación de las burbujas de gas que interactúan con las membranas celulares cercanas, ya que se ve reforzada por la adición de un agente de contraste de ultrasonidos, una fuente de núcleos de cavitación.
- La transfección óptica es un método en el que se genera transitoriamente un orificio diminuto (~ 1 µm de diámetro) en la membrana plasmática de una célula utilizando un láser altamente enfocado. Esta técnica fue descrita por primera vez en 1984 por Tsukakoshi et al., Quienes utilizaron una frecuencia de Nd: YAG triplicada para generar una transfección estable y transitoria de células renales normales de rata. [23] En esta técnica, se trata una célula a la vez, lo que la hace particularmente útil para el análisis de células individuales.
- La fusión de protoplastos es una técnica en la que las células bacterianas transformadas se tratan con lisozima para eliminar la pared celular. A continuación, se utilizan agentes fusogénicos (por ejemplo, virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar el protoplasto que lleva el gen de interés con la célula receptora diana. Una desventaja importante de este método es que los componentes bacterianos también se introducen de forma no específica en la célula diana.
- La impalefección es un método para introducir ADN unido a una superficie de una nanofibra que se inserta en una célula. Este enfoque también se puede implementar con matrices de nanofibras que se introducen en un gran número de células y tejido intacto.
- La administración hidrodinámica es un método que se usa en ratones y ratas, pero en menor medida en animales más grandes, en el que el ADN de los plásmidos (incluidos los transposones ) con mayor frecuencia se puede administrar al hígado mediante una inyección hidrodinámica que implica la infusión de un volumen relativamente grande en la sangre. sangre en menos de 10 segundos; casi todo el ADN se expresa en el hígado mediante este procedimiento. [24] [25] [26]
Métodos basados en partículas
- Un enfoque directo de la transfección es la pistola de genes , donde el ADN se acopla a una nanopartícula de un sólido inerte (comúnmente oro), que luego se "dispara" directamente en el núcleo de la célula objetivo . [27]
- La magnetofección , o transfección asistida por imán , es un método de transfección que utiliza la fuerza magnética para llevar ADN a las células diana. Los ácidos nucleicos se asocian primero con nanopartículas magnéticas. Luego, la aplicación de la fuerza magnética impulsa los complejos de partículas de ácido nucleico hacia y dentro de las células objetivo, donde se libera la carga. [28]
- La impalefección se lleva a cabo empalando células mediante nanoestructuras alargadas y matrices de nanoestructuras tales como nanofibras de carbono o nanocables de silicio que se han funcionalizado con ADN plasmídico .
- Otro método de transfección basado en partículas se conoce como bombardeo de partículas. El ácido nucleico se administra a través de la penetración de la membrana a alta velocidad, generalmente conectado a microproyectiles. [2]
Otros métodos (e híbridos)
Otros métodos de transfección incluyen la nucleofección , que ha demostrado ser muy eficaz en la transfección de la línea celular THP-1 , creando una línea celular viable que pudo diferenciarse en macrófagos maduros [29] y el choque térmico .
Métodos virales
El ADN también se puede introducir en las células utilizando virus como portadores. En tales casos, la técnica se llama transducción y se dice que las células se transducen. Los vectores adenovirales pueden ser útiles para los métodos de transfección viral porque pueden transferir genes a una amplia variedad de células humanas y tienen altas tasas de transferencia. [2] Los vectores lentivirales también son útiles debido a su capacidad para transducir células que actualmente no experimentan mitosis.
Transfección estable y transitoria
La transfección estable y transitoria difieren en sus efectos a largo plazo en una célula; una célula transfectada de manera estable expresará continuamente el ADN transfectado y lo pasará a las células hijas , mientras que una célula transfectada transitoriamente expresará el ADN transfectado durante un corto período de tiempo y no lo transmitirá a las células hijas.
Para algunas aplicaciones de transfección, es suficiente si el material genético transfectado solo se expresa transitoriamente. Dado que el ADN introducido en el proceso de transfección generalmente no se integra en el genoma nuclear, el ADN extraño se diluirá mediante mitosis o se degradará. [30] Las líneas celulares que expresan el antígeno nuclear 1 (EBNA1) del virus de Epstein-Barr (EBV) o el antígeno T grande de SV40 permiten la amplificación episomal de plásmidos que contienen los orígenes de replicación del virus de EBV (293E) o SV40 (293T), en gran medida reduciendo la tasa de dilución. [31]
Si se desea que el gen transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. Para lograr esto, se cotransfecta un gen marcador , lo que le da a la célula alguna ventaja seleccionable, como la resistencia a una determinada toxina . Algunas (muy pocas) de las células transfectadas, por casualidad, habrán integrado el material genético extraño en su genoma. Si luego se agrega la toxina al cultivo celular, solo esas pocas células con el gen marcador integrado en sus genomas podrán proliferar , mientras que otras células morirán. Después de aplicar este estrés selectivo (presión de selección) durante algún tiempo, solo quedan las células con una transfección estable y pueden cultivarse más. [32]
Los agentes comunes para seleccionar la transfección estable son:
- Geneticina , o G418, neutralizada por el producto del gen de resistencia a la neomicina
- Puromicina
- Zeocina
- Higromicina B
- Blasticidina S
Transfección de ARN
El ARN también se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada o para estudiar la cinética de desintegración del ARN . La transfección de ARN se usa a menudo en células primarias que no se dividen.
Los ARNip también se pueden transfectar para lograr el silenciamiento del ARN (es decir, pérdida de ARN y proteína del gen diana). Esto se ha convertido en una aplicación importante en la investigación para lograr la " eliminación " de proteínas de interés (por ejemplo, Endotelina-1 [33] ) con aplicaciones potenciales en terapia génica. La limitación del enfoque de silenciamiento son la toxicidad de la transfección para las células y los posibles efectos "fuera del objetivo" sobre la expresión de otros genes / proteínas.
Ver también
- Orientación genética
- Minicírculo
- Protofección
- Transformación
- Transducción
- Transgén
- Vector (biología molecular)
- Vector viral
Referencias
- ^ Transfección en los encabezados de temas médicos de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.(MeSH)
- ^ a b c d "Transfección" . Guía de protocolos y aplicaciones . Promega.
- ^ Transducción, genética en los encabezados de temas médicos de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.(MeSH)
- ^ " Transfección " en el Diccionario médico de Dorland
- ^ Kamimura K, Suda T, Zhang G, Liu D (octubre de 2011). "Avances en los sistemas de entrega de genes" . Medicina farmacéutica . 25 (5): 293-306. doi : 10.1007 / bf03256872 . PMC 3245684 . PMID 22200988 .
- ^ Saul JM, Linnes MP, Ratner BD, Giachelli CM, Pun SH (noviembre de 2007). "Entrega de portadores de genes no virales de andamios de fibrina con plantilla de esfera para una expresión transgénica sostenida". Biomateriales . 28 (31): 4705–16. doi : 10.1016 / j.biomaterials.2007.07.026 . PMID 17675152 .
- ^ Menuel S, Fontanay S, Clarot I, Duval RE, Diez L, Marsura A (diciembre de 2008). "Capacidad de síntesis y complejación de un nuevo tetrápodo dendrimérico de bis- (guanidinio) -tetrakis- (beta-ciclodextrina) como un sistema de suministro de genes potencial (ADN y ARNip). Estudio de la transfección celular de ARNip". Química del bioconjugado . 19 (12): 2357–62. doi : 10.1021 / bc800193p . PMID 19053312 .
- ^ Fischer D, von Harpe A, Kunath K, Petersen H, Li Y, Kissel T (2002). "Copolímeros de etilenimina y N- (2-hidroxietil) -etilenimina como herramientas para estudiar los efectos de la estructura del polímero sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas de los complejos de ADN". Química del bioconjugado . 13 (5): 1124–33. doi : 10.1021 / bc025550w . PMID 12236795 .
- ^ "Reactivos de transfección basados en nanopartículas" . Recurso de investigación en biología transfección . Transfection.ws.
- ^ Graham FL, van der Eb AJ (abril de 1973). "Una nueva técnica para el ensayo de infectividad del ADN del adenovirus 5 humano". Virología . 52 (2): 456–67. doi : 10.1016 / 0042-6822 (73) 90341-3 . PMID 4705382 .
- ^ Bacchetti S, Graham FL (abril de 1977). "Transferencia del gen de la timidina quinasa a células humanas deficientes en timidina quinasa mediante ADN viral de herpes simple purificado" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 74 (4): 1590–4. Código Bibliográfico : 1977PNAS ... 74.1590B . doi : 10.1073 / pnas.74.4.1590 . PMC 430836 . PMID 193108 .
- ^ Kriegler M (1991). Transferencia y expresión: un manual de laboratorio . WH Freeman. págs. 96–97. ISBN 978-0-7167-7004-6.
- ^ Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M (noviembre de 1987). "Lipofección: un procedimiento de transfección de ADN mediado por lípidos altamente eficaz" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 84 (21): 7413–7. Código Bibliográfico : 1987PNAS ... 84.7413F . doi : 10.1073 / pnas.84.21.7413 . PMC 299306 . PMID 2823261 .
- ^ Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, Tsai YJ, Border R, Ramsey P, Martin M, Felgner PL (enero de 1994). "Estudios de mecanismos y entrega de genes mejorados con una nueva serie de formulaciones de lípidos catiónicos" . La revista de química biológica . 269 (4): 2550–61. doi : 10.1016 / S0021-9258 (17) 41980-6 . PMID 8300583 .
- ^ Pipes BL, Vasanwala FH, Tsang TC, Zhang T, Luo P, Harris DT (enero de 2005). "Breve choque térmico aumenta la integración estable de transfecciones de ADN mediadas por lípidos" . BioTechniques . 38 (1): 48–52. doi : 10.2144 / 05381bm05 . PMID 15679084 .
- ^ Jacobsen LB, Calvin SA, Colvin KE, Wright M (junio de 2004). "Reactivo de transfección FuGENE 6: el poder suave". Métodos . Transfección de células de mamíferos. 33 (2): 104-12. doi : 10.1016 / j.ymeth.2003.11.002 . PMID 15121164 .
- ^ Hellgren I, Drvota V, Pieper R, Enoksson S, Blomberg P, Islam KB, Sylvén C (agosto de 2000). "Transferencia de genes mediada por células de alta eficiencia utilizando vectores no virales y FuGene6: estudios in vitro e in vivo". Ciencias de la vida celular y molecular . 57 (8–9): 1326–33. doi : 10.1007 / PL00000769 . PMID 11028922 . S2CID 27916034 .
- ^ Lakshmipathy U, Thyagarajan B (2011). Células primarias y madre: tecnologías y aplicaciones de transferencia de genes (1ª ed.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-0-470-61074-9.
- ^ Arnold AS, Laporte V, Dumont S, Appert-Collin A, Erbacher P, Coupin G, Levy R, Poindron P, Gies JP (febrero de 2006). "Comparación de reactivos para la transfección eficiente de mioblastos primarios humanos: FuGENE 6, Effectene y ExGen 500". Farmacología fundamental y clínica . 20 (1): 81–9. doi : 10.1111 / j.1472-8206.2005.00344.x . PMID 16448398 . S2CID 42585711 .
- ^ Sapra, Rachit; Verma, Ram P .; Maurya, Govind P .; Dhawan, Sameer; Babu, Jisha; Haridas, V. (13 de noviembre de 2019). "Diseñador de péptidos y dendrímeros de proteínas: un análisis transversal". Revisiones químicas . 119 (21): 11391-11441. doi : 10.1021 / acs.chemrev.9b00153 . ISSN 0009-2665 . PMID 31556597 .
- ^ Heitz, Marc; Javor, Sacha; Darbre, Tamis; Reymond, Jean-Louis (21 de agosto de 2019). "Dendrímeros de péptidos sensibles al pH estereoselectivo para la transfección de ARNip". Química del bioconjugado . 30 (8): 2165–2182. doi : 10.1021 / acs.bioconjchem.9b00403 . ISSN 1043-1802 . PMID 31398014 .
- ^ Sharei A, Zoldan J, Adamo A, Sim WY, Cho N, Jackson E, Mao S, Schneider S, Han MJ, Lytton-Jean A, Basto PA, Jhunjhunwala S, Lee J, Heller DA, Kang JW, Hartoularos GC, Kim KS, Anderson DG, Langer R, Jensen KF (febrero de 2013). "Una plataforma de microfluidos libre de vectores para la entrega intracelular" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 110 (6): 2082–7. Código bibliográfico : 2013PNAS..110.2082S . doi : 10.1073 / pnas.1218705110 . PMC 3568376 . PMID 23341631 .
- ^ Tsukakoshi M, Kurata S, Nomiya Y, et al. (1984). "Un nuevo método de transfección de ADN por cirugía de células de microhaz láser". Física Aplicada B: Fotofísica y Química Láser . 35 (3): 135–140. Código bibliográfico : 1984ApPhB..35..135T . doi : 10.1007 / BF00697702 . S2CID 123250337 .
- ^ Zhang G, Budker V, Wolff JA (julio de 1999). "Altos niveles de expresión de genes extraños en hepatocitos después de inyecciones de ADN plasmídico desnudo en la vena de la cola". Terapia de genes humanos . 10 (10): 1735–7. doi : 10.1089 / 10430349950017734 . PMID 10428218 .
- ^ Zhang G, Vargo D, Budker V, Armstrong N, Knechtle S, Wolff JA (octubre de 1997). "Expresión de ADN plasmídico desnudo inyectado en los vasos aferentes y eferentes de hígados de roedores y perros". Terapia de genes humanos . 8 (15): 1763–72. doi : 10.1089 / hum.1997.8.15-1763 . PMID 9358026 .
- ^ Bell JB, Podetz-Pedersen KM, Aronovich EL, Belur LR, McIvor RS, Hackett PB (2007). "Entrega preferencial del sistema de transposones de la Bella Durmiente a hígados de ratones mediante inyección hidrodinámica" . Protocolos de la naturaleza . 2 (12): 3153–65. doi : 10.1038 / nprot.2007.471 . PMC 2548418 . PMID 18079715 .
- ^ O'Brien, John A .; Lummis, Sarah CR (2011). "Nanobiolística: un método de transfección biolística de células y tejidos utilizando una pistola de genes con proyectiles novedosos de tamaño nanométrico" . Biotecnología BMC . 11 : 66. doi : 10.1186 / 1472-6750-11-66 . PMC 3144454 . PMID 21663596 .
- ^ "Magnetofección - transfección y transducción magnética asistida" . OzBiosciences: el arte de los sistemas de administración.
- ^ Schnoor M, Buers I, Sietmann A, Brodde MF, Hofnagel O, Robenek H, Lorkowski S (mayo de 2009). "Transfección no viral eficiente de células THP-1". Revista de métodos inmunológicos . 344 (2): 109-15. doi : 10.1016 / j.jim.2009.03.014 . PMID 19345690 .
- ^ Kim TK, Eberwine JH (agosto de 2010). "Transfección de células de mamíferos: el presente y el futuro" . Química analítica y bioanalítica . 397 (8): 3173–8. doi : 10.1007 / s00216-010-3821-6 . PMC 2911531 . PMID 20549496 .
- ^ Durocher Y, Perret S, Kamen A (enero de 2002). "Producción de proteína recombinante de alto nivel y alto rendimiento por transfección transitoria de células 293-EBNA1 humanas en crecimiento en suspensión" . Investigación de ácidos nucleicos . 30 (2): 9e – 9. doi : 10.1093 / nar / 30.2.e9 . PMC 99848 . PMID 11788735 .
- ^ Fanelli A (2016). "La ciencia de la generación de líneas celulares estables" . Consultado el 23 de diciembre de 2017 .
- ^ Mawji IA, Marsden PA (junio de 2006). "La transfección de ARN es una herramienta versátil para investigar la regulación postranscripcional de endotelina-1" . Biología y Medicina Experimental . 231 (6): 704–708. doi : 10.3181 / 00379727-231-2310704 (inactivo el 31 de mayo de 2021). PMID 16740984 .Mantenimiento de CS1: DOI inactivo a partir de mayo de 2021 ( enlace )
Otras lecturas
- Segura T, Shea LD (2001). "Materiales para la entrega de genes no virales". Revisión anual de la investigación de materiales . 31 : 25–46. Código bibliográfico : 2001AnRMS..31 ... 25S . doi : 10.1146 / annurev.matsci.31.1.25 .
- Luo D, Saltzman WM (enero de 2000). "Sistemas de entrega de ADN sintético". Biotecnología de la naturaleza . 18 (1): 33–7. doi : 10.1038 / 71889 . PMID 10625387 . S2CID 7068508 .
- Bonetta L (2005). "La primicia: evaluación de métodos de entrega de genes". Métodos de la naturaleza . 2 (11): 875–883. doi : 10.1038 / nmeth1105-875 . S2CID 8078059 .
enlaces externos
- Transfección en los títulos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Recurso de investigación en biología: artículos y foros sobre transfección
- Investigación en transfección óptica en la Universidad de St Andrews
- El décimo simposio entre Estados Unidos y Japón sobre sistemas de administración de fármacos