Un experimento de una sola molécula es un experimento que investiga las propiedades de moléculas individuales . Los estudios de una sola molécula pueden contrastarse con las mediciones en un conjunto o una colección masiva de moléculas, donde no se puede distinguir el comportamiento individual de las moléculas y solo se pueden medir las características promedio . Dado que muchas técnicas de medición en biología, química y física no son lo suficientemente sensibles para observar moléculas individuales, la fluorescencia de una sola moléculaLas técnicas (que han surgido desde la década de 1990 para sondear varios procesos a nivel de moléculas individuales) causaron mucho entusiasmo, ya que proporcionaron muchos detalles nuevos sobre los procesos medidos que no eran accesibles en el pasado. De hecho, desde la década de 1990, se han desarrollado muchas técnicas para sondear moléculas individuales. [2]
Los primeros experimentos de una sola molécula fueron experimentos de pinzamiento de parche realizados en la década de 1970, pero se limitaron al estudio de los canales iónicos . En la actualidad, los sistemas investigados mediante técnicas de una sola molécula incluyen el movimiento de la miosina en los filamentos de actina del tejido muscular y los detalles espectroscópicos de los entornos locales individuales en los sólidos. Las conformaciones de los polímeros biológicos se han medido mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Usando espectroscopía de fuerza , moléculas individuales (o pares de moléculas que interactúan), generalmente polímeros , se pueden estirar mecánicamente y registrar su respuesta elástica en tiempo real.
Historia
En la fase gaseosa a presiones ultrabajas, los experimentos de una sola molécula han existido durante décadas, pero en la fase condensada solo desde 1989 con el trabajo de WE Moerner y Lothar Kador. [3] Un año después, Michel Orrit y Jacky Bernard pudieron mostrar también la detección de la absorción de moléculas individuales por su fluorescencia. [4]
Muchas técnicas tienen la capacidad de observar una molécula a la vez, sobre todo la espectrometría de masas , donde se detectan iones individuales. Además, uno de los primeros medios para detectar moléculas individuales, surgió en el campo de los canales iónicos con el desarrollo de la técnica del patch clamp por Erwin Neher y Bert Sakmann (quienes luego ganaron el premio Nobel por sus contribuciones fundamentales). Sin embargo, la idea de medir la conductancia para observar moléculas individuales imponía una seria limitación al tipo de sistemas que podían observarse.
La fluorescencia es un medio conveniente de observar una molécula a la vez, principalmente debido a la sensibilidad de los detectores ópticos comerciales, capaces de contar fotones individuales. Sin embargo, espectroscópicamente, la observación de una molécula requiere que la molécula se encuentre en un entorno aislado y que emita fotones al excitarse, lo que debido a la tecnología para detectar fotones individuales mediante el uso de tubos fotomultiplicadores (PMT) o fotodiodos de avalancha (APD), permite registrar eventos de emisión de fotones con gran sensibilidad y resolución de tiempo.
Más recientemente, la fluorescencia de una sola molécula es un tema de gran interés para las imágenes biológicas, a través del etiquetado de biomoléculas como proteínas y nucleótidos para estudiar la función enzimática que no se puede estudiar fácilmente a gran escala, debido a los sutiles movimientos dependientes del tiempo en la catálisis. y reorganización estructural. La proteína más estudiada ha sido la clase de enzimas miosina / actina que se encuentran en los tejidos musculares. Mediante técnicas de molécula única, se ha observado y caracterizado el mecanismo escalonado en muchas de estas proteínas.
Los nanomanipuladores, como el microscopio de fuerza atómica , también son adecuados para experimentos de una sola molécula de importancia biológica, ya que funcionan en la misma escala de longitud que la mayoría de los polímeros biológicos. Además, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es apropiada para el estudio de moléculas de polímeros sintéticos. AFM ofrece una posibilidad única de visualización 3D de cadenas de polímeros. Por ejemplo, el modo de golpeteo AFM es lo suficientemente suave para el registro de moléculas de polielectrolito adsorbidas (por ejemplo, cadenas de poli (2-vinilpiridina) de 0,4 nm de espesor) en medio líquido. La ubicación de la superposición de dos cadenas corresponde en estos experimentos al doble del grosor de la cadena simple (0,8 nm en el caso del ejemplo mencionado). Con la aplicación de los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de tales moléculas permanece sin cambios durante horas, lo que permite la realización de experimentos en medios líquidos que tienen varias propiedades. [1] Además, al controlar la fuerza entre la punta y la muestra, se pueden obtener imágenes de alta resolución. adquirido. [5] [6] También se han utilizado pinzas ópticas para estudiar y cuantificar las interacciones ADN-proteína. [5] [6]
Sobre los experimentos
Concepto
La espectroscopia de fluorescencia de molécula única utiliza la fluorescencia de una molécula para obtener información sobre su entorno, estructura y posición. La técnica ofrece la capacidad de obtener información que de otro modo no estaría disponible debido al promedio de conjuntos (es decir, una señal obtenida cuando se registran muchas moléculas al mismo tiempo representa una propiedad promedio de la dinámica de las moléculas). Los resultados de muchos experimentos de moléculas individuales son trayectorias de dos estados .
Grabación de un solo canal
Como en el caso de la espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula, la técnica conocida como grabación de un solo canal se puede utilizar para obtener información cinética específica, en este caso sobre la función del canal iónico, que no está disponible cuando se realiza la grabación en conjunto, como la grabación de células completas. realizado. [7] Específicamente, los canales iónicos alternan entre clases conductoras y no conductoras, que difieren en conformación. Por lo tanto, el estado funcional de los canales iónicos se puede medir directamente con componentes electrónicos suficientemente sensibles, siempre que se tomen las precauciones adecuadas para minimizar el ruido. A su vez, cada una de estas clases puede dividirse en uno o más estados cinéticos que influyen directamente en la función subyacente del canal iónico. La realización de estos tipos de estudios de moléculas individuales en condiciones que varían sistemáticamente (por ejemplo, concentración y estructura de agonistas, iones permeantes y / o bloqueadores de canales, mutaciones en los aminoácidos del canal iónico), puede proporcionar información sobre la interconversión de varios estados cinéticos del canal iónico. En un modelo mínimo para un canal de iones, hay dos estados : abierto y cerrado. Sin embargo, a menudo se necesitan otros estados para representar con precisión los datos, incluidos múltiples estados cerrados, así como estados inactivos y / o desensibilizados, que son estados no conductores que pueden ocurrir incluso en presencia de estímulos. [7]
Etiquetado de biomoléculas
Los fluoróforos individuales se pueden unir químicamente a biomoléculas, como proteínas o ADN, y la dinámica de moléculas individuales se puede rastrear controlando la sonda fluorescente. Se pueden rastrear los movimientos espaciales dentro del límite de Rayleigh , junto con los cambios en la intensidad de las emisiones y / o la vida útil radiativa, que a menudo indican cambios en el entorno local. Por ejemplo, el etiquetado de una sola molécula ha proporcionado una gran cantidad de información sobre cómo las proteínas motoras de kinesina se mueven a lo largo de las cadenas de microtúbulos en las células musculares.
Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula (FRET)
Artículo principal smFRET .
En la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula , la molécula se etiqueta en (al menos) dos lugares. Un rayo láser se enfoca en la molécula que excita la primera sonda. Cuando esta sonda se relaja y emite un fotón, tiene la posibilidad de excitar la otra sonda. La eficiencia de la absorción del fotón emitido por la primera sonda en la segunda sonda depende de la distancia entre estas sondas. Dado que la distancia cambia con el tiempo, este experimento prueba la dinámica interna de la molécula.
Experimentos de una sola molécula versus experimentos de conjuntos
Cuando se observan datos relacionados con moléculas individuales, generalmente se pueden construir propagadores y funciones de densidad de probabilidad de tiempo de salto, de primer orden, segundo orden, etc., mientras que a partir de experimentos a granel, generalmente se obtiene la desintegración de una función de correlación. [8] A partir de la información contenida en estas funciones únicas (obtenidas de moléculas individuales), se puede extraer una imagen relativamente clara de la forma en que se comporta el sistema; por ejemplo, su esquema cinético , [9] o su potencial de actividad, o su forma de dimensiones reducidas . [10] [11] En particular, se pueden construir (muchas propiedades de) la vía de reacción de una enzima cuando se monitorea la actividad de una enzima individual. [12] Además, varios autores han descrito aspectos importantes relacionados con el análisis de datos de una sola molécula, como métodos de ajuste y pruebas para poblaciones homogéneas. [7] Por otro lado, existen varios problemas con el análisis de datos de una sola molécula, incluida la construcción de un entorno de bajo ruido y puntas de pipeta aisladas, el filtrado de algunos de los componentes no deseados restantes (ruido) que se encuentran en las grabaciones y el período de tiempo necesarios para el análisis de datos (preprocesamiento, detección de eventos inequívocos, trazado de datos, ajuste de esquemas cinéticos, etc.).
Impacto
Las técnicas de una sola molécula afectaron la óptica, la electrónica, la biología y la química. En las ciencias biológicas, el estudio de las proteínas y otra maquinaria biológica compleja se limitaba a experimentos conjuntos que casi imposibilitaban la observación directa de su cinética. Por ejemplo, fue solo después de que se usó microscopía de fluorescencia de una sola molécula para estudiar pares de kinesina-miosina en el tejido muscular que se entendió la observación directa de los mecanismos de la marcha. Sin embargo, estos experimentos se han limitado en su mayor parte a estudios in vitro, ya que todavía no se han realizado completamente técnicas útiles para la obtención de imágenes de células vivas. Sin embargo, la promesa de la obtención de imágenes in vivo de una sola molécula [13] trae consigo un enorme potencial para observar directamente biomoléculas en procesos nativos. Estas técnicas a menudo están destinadas a estudios que involucran proteínas de baja copia, muchas de las cuales aún se están descubriendo. Estas técnicas también se han extendido para estudiar áreas de la química, incluido el mapeo de superficies heterogéneas. [14]
Ver también
- Imán de una sola molécula
- Espectroscopia de fuerza
- Pinzas magnéticas
- Pinzas ópticas
- Seguimiento de una sola partícula
- Espectroscopía Raman
- Microscopía de sonda de barrido
- Microscopio de electrones
- Movimiento de partículas atadas (TPM)
- Microscopía de súper resolución
- Abrazadera de voltaje
- Detección de pulso resistivo sintonizable
- Secuenciación en tiempo real de una sola molécula
Referencias
- ^ a b Y. Roiter y S. Minko, AFM Experimentos de molécula única en la interfaz sólido-líquido: conformación in situ de cadenas de polielectrolito flexibles adsorbidas , Revista de la Sociedad Química Estadounidense, vol. 127, edición. 45, págs. 15688-15689 (2005)
- ^ Juette, MF; Terry, DS; Wasserman, MR; Zhou, Z; Altman, RB; Zheng, Q; Blanchard, SC (junio de 2014). "El futuro brillante de la formación de imágenes de fluorescencia de una sola molécula" . Curr Opin Chem Biol . 20 : 103-11. doi : 10.1016 / j.cbpa.2014.05.010 . PMC 4123530 . PMID 24956235 .
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- ^ a b Murugesapillai, D .; et al. (2016). "Estudios de molécula única de proteínas de flexión del ADN arquitectónico del grupo B de alta movilidad" . Biophys Rev . 9 (1): 17–40. doi : 10.1007 / s12551-016-0236-4 . PMC 5331113 . PMID 28303166 .
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