La secuenciación en tiempo real de una sola molécula ( SMRT ) es un método de secuenciación de ADN de una sola molécula en paralelo . La secuenciación en tiempo real de una sola molécula utiliza una guía de ondas de modo cero (ZMW). [1] Se fija una sola enzima ADN polimerasa en la parte inferior de una ZMW con una sola molécula de ADN como plantilla. El ZMW es una estructura que crea un volumen de observación iluminado que es lo suficientemente pequeño como para observar que solo un nucleótido de ADN es incorporado por la ADN polimerasa.. Cada una de las cuatro bases de ADN está unida a uno de los cuatro tintes fluorescentes diferentes. Cuando la ADN polimerasa incorpora un nucleótido, la etiqueta fluorescente se escinde y se difunde fuera del área de observación del ZMW donde ya no se puede observar su fluorescencia. Un detector detecta la señal fluorescente de la incorporación de nucleótidos y la llamada de base se realiza según la fluorescencia correspondiente del tinte. [2]
Tecnología
La secuenciación del ADN se realiza en un chip que contiene muchos ZMW. Dentro de cada ZMW, una única ADN polimerasa activa con una sola molécula de plantilla de ADN monocatenario se inmoviliza en el fondo a través del cual la luz puede penetrar y crear una cámara de visualización que permite monitorear la actividad de la ADN polimerasa a nivel de molécula única. La señal de un nucleótido ligado a fosfo incorporado por la ADN polimerasa se detecta a medida que avanza la síntesis de ADN, lo que da como resultado la secuenciación del ADN en tiempo real.
Nucleótido fosfolincado
Para cada una de las bases de nucleótidos, hay una molécula de colorante fluorescente correspondiente que permite al detector identificar la base que está incorporando la ADN polimerasa mientras realiza la síntesis de ADN . La molécula de tinte fluorescente está unida a la cadena de fosfato del nucleótido. Cuando el nucleótido es incorporado por la ADN polimerasa, el tinte fluorescente se escinde con la cadena de fosfato como parte de un proceso de síntesis de ADN natural durante el cual se crea un enlace fosfodiéster para alargar la cadena de ADN. La molécula de tinte fluorescente escindida luego se difunde fuera del volumen de detección de modo que ya no se detecta la señal fluorescente. [3]
Guía de ondas de modo cero
La guía de ondas de modo cero (ZMW) es una estructura de confinamiento nanofotónico que consiste en un orificio circular en una película de revestimiento de aluminio depositada sobre un sustrato de sílice transparente. [4]
Los orificios de ZMW tienen ~ 70 nm de diámetro y ~ 100 nm de profundidad. Debido al comportamiento de la luz cuando viaja a través de una pequeña apertura, el campo óptico decae exponencialmente dentro de la cámara. [5]
El volumen de observación dentro de un ZMW sistema de iluminación es de ~ 20 zeptoliters (20 X 10 -21 litros). Dentro de este volumen, la actividad de la ADN polimerasa que incorpora un solo nucleótido puede detectarse fácilmente. [3]
Rendimiento de secuenciación
El rendimiento de la secuenciación se puede medir en longitud de lectura, precisión y rendimiento total por experimento. Los sistemas de secuenciación PacBio que utilizan ZMW tienen la ventaja de que las lecturas son largas, aunque las tasas de error son del orden del 5 al 15% y el rendimiento de las muestras es menor que las plataformas de secuenciación de Illumina . [6]
El 19 de septiembre de 2018, Pacific Biosciences [PacBio] lanzó la química Sequel 6.0, sincronizando la versión química con la versión del software. El rendimiento se contrasta para las bibliotecas de insertos grandes con ADN de alto peso molecular frente a las bibliotecas de insertos más cortos por debajo de ~ 15.000 bases de longitud. Para plantillas más grandes, las longitudes de lectura promedio son de hasta 30.000 bases. Para bibliotecas de insertos más cortos, la longitud de lectura promedio es de hasta 100,000 bases mientras se lee la misma molécula en un círculo. Las últimas bibliotecas de insertos más cortos producen hasta 50 mil millones de bases a partir de una sola celda SMRT. [7]
Historia
Pacific Biosciences (PacBio) comercializó la secuenciación SMRT en 2011, [8] después de lanzar una versión beta de su instrumento RS a finales de 2010. [9]
RS y RS II
En el momento de la comercialización, la longitud de lectura tenía una distribución normal con una media de aproximadamente 1100 bases. Un nuevo kit de química lanzado a principios de 2012 aumentó la longitud de lectura del secuenciador; uno de los primeros clientes de la química citó longitudes de lectura medias de 2500 a 2900 bases. [10]
El kit de química XL lanzado a finales de 2012 aumentó la longitud de lectura promedio a más de 4300 bases. [11] [12]
El 21 de agosto de 2013, PacBio lanzó el nuevo kit de unión de ADN polimerasa P4. Esta enzima P4 tiene longitudes de lectura promedio de más de 4,300 bases cuando se combina con la química de secuenciación C2 y más de 5,000 bases cuando se combina con la química XL. [13] La precisión de la enzima es similar a la de C2, alcanzando QV50 entre una cobertura de 30X y 40X. Los atributos de P4 resultantes proporcionaron ensamblajes de mayor calidad utilizando menos celdas SMRT y con llamadas de variantes mejoradas. [13] Cuando se combina con la selección del tamaño del ADN de entrada (utilizando un instrumento de electroforesis como BluePippin) se obtiene una longitud de lectura promedio de más de 7 kilobases. [14]
El 3 de octubre de 2013, PacBio lanzó una nueva combinación de reactivos para PacBio RS II, la ADN polimerasa P5 con química C3 (P5-C3). Juntos, extienden las longitudes de lectura de secuenciación a un promedio de aproximadamente 8.500 bases, y las lecturas más largas superan las 30.000 bases. [15] El rendimiento por celda SMRT es de alrededor de 500 millones de bases, demostrado por los resultados de secuenciación de la línea celular CHM1. [dieciséis]
El 15 de octubre de 2014, PacBio anunció el lanzamiento de la nueva química P6-C4 para el sistema RS II, que representa la sexta generación de polimerasa y la química de cuarta generación de la compañía, extiende aún más la longitud de lectura promedio a 10,000 - 15,000 bases, con la más larga lee más de 40.000 bases. Se esperaba que el rendimiento con la nueva química estuviera entre 500 millones y mil millones de bases por celda SMRT, dependiendo de la muestra que se secuenciara. [17] [18] Esta fue la versión final de la química lanzada para el instrumento RS.
El rendimiento por experimento de la tecnología está influenciado tanto por la longitud de lectura de las moléculas de ADN secuenciadas como por el múltiplex total de una célula SMRT. El prototipo de la célula SMRT contenía alrededor de 3000 agujeros ZMW que permitían la secuenciación del ADN en paralelo. En el momento de la comercialización, cada una de las celdas SMRT se modeló con 150.000 orificios de ZMW que se leyeron en dos conjuntos de 75.000. [19] En abril de 2013, la compañía lanzó una nueva versión del secuenciador llamada "PacBio RS II" que utiliza todos los 150.000 agujeros ZMW al mismo tiempo, duplicando el rendimiento por experimento. [20] [21] El modo de rendimiento más alto en noviembre de 2013 usó unión P5, química C3, selección de tamaño de BluePippin y un PacBio RS II produjo oficialmente 350 millones de bases por celda SMRT a través de un conjunto de datos humanos de novo publicado con una química promedio de 500 millones de bases por celda SMRT. El rendimiento varía según el tipo de muestra que se secuencia. [22] Con la introducción de la química P6-C4, el rendimiento típico por celda SMRT aumentó de 500 millones de bases a mil millones de bases.
C1 | C2 | P4-XL | P5-C3 | P6-C4 | |
---|---|---|---|---|---|
Bases de longitud de lectura promedio | 1100 | 2500 - 2900 | 4300 - 5000 | 8500 | 10,000 - 15,000 |
Rendimiento por celda SMRT | 30M - 40M | 60M - 100M | 250M - 300M | 350M - 500M | 500M - 1B |
Continuación
En septiembre de 2015, la compañía anunció el lanzamiento de un nuevo instrumento de secuenciación, el Sistema Sequel, que aumentó la capacidad a 1 millón de pozos ZMW. [23] [24]
Con el instrumento Sequel, las longitudes de lectura iniciales eran comparables a las del RS, luego las versiones químicas posteriores aumentaron la longitud de lectura.
El 23 de enero de 2017, se lanzó la química V2. Aumentó las longitudes de lectura promedio a entre 10,000 y 18,000 bases. [25]
El 8 de marzo de 2018, se lanzó la química 2.1. Aumentó la longitud de lectura promedio a 20.000 bases y la mitad de todas las lecturas por encima de las 30.000 bases de longitud. El rendimiento por célula SMRT aumentó a 10 o 20 mil millones de bases, ya sea para bibliotecas de inserto grande o bibliotecas de inserto más corto (por ejemplo, amplicón ), respectivamente. [26]
El 19 de septiembre de 2018, la compañía anunció la química de Sequel 6.0 con longitudes de lectura promedio aumentadas a 100,000 bases para bibliotecas de insertos más cortos y 30,000 para bibliotecas de insertos más largos. El rendimiento de las células SMRT aumentó hasta 50 mil millones de bases para bibliotecas de insertos más cortos. [7]
V2 | 2.1 | 6.0 | |
---|---|---|---|
Bases de longitud de lectura promedio | 10,000 - 18,000 | 20.000 - 30.000 | 30.000 - 100.000 |
Rendimiento por celda SMRT | 5B - 8B | 10B - 20B | 20B - 50B |
Chip de 8M
En abril de 2019, la compañía lanzó una nueva celda SMRT con ocho millones de ZMW, [27] aumentando el rendimiento esperado por celda SMRT en un factor de ocho. [28] Los clientes de acceso temprano en marzo de 2019 informaron un rendimiento de más de 58 celdas ejecutadas por clientes de 250 GB de rendimiento bruto por celda con plantillas de aproximadamente 15 kb de longitud y 67,4 GB de rendimiento por celda con plantillas en moléculas de mayor peso. [29] El rendimiento del sistema ahora se informa en lecturas largas continuas de alto peso molecular o en lecturas HiFi precorregidas (también conocidas como secuencias de consenso circular (CCS)). Para las lecturas de alto peso molecular, aproximadamente la mitad de todas las lecturas tienen una longitud superior a 50 kb.
Acceso temprano | 1.0 | 2.0 | |
---|---|---|---|
Rendimiento por celda SMRT | ~ 67,4 GB | Hasta 160 GB | Hasta 200 GB |
El rendimiento de HiFi incluye bases corregidas con una calidad superior a la puntuación Phred Q20, utilizando pases de amplicón repetidos para la corrección. Estos toman amplicones de hasta 20 kb de longitud.
Acceso temprano | 1.0 | 2.0 | |
---|---|---|---|
Lecturas sin procesar por celda SMRT | ~ 250 GB | Hasta 360 GB | Hasta 500 GB |
Lecturas corregidas por celda SMRT (> Q20) | ~ 25 GB | Hasta 36 GB | Hasta 50 GB |
Solicitud
La secuenciación en tiempo real de una sola molécula puede ser aplicable a una amplia gama de investigaciones genómicas.
Para la secuenciación del genoma de novo , las longitudes de lectura de la secuenciación en tiempo real de una sola molécula son comparables o mayores que las del método de secuenciación de Sanger basado en la terminación de la cadena de didesoxinucleótidos . La longitud de lectura más larga permite la secuenciación del genoma de novo y ensamblajes genómicos más fáciles. [2] [30] [31] Los científicos también están usando secuenciación en tiempo real de una sola molécula en ensamblajes híbridos para genomas de novo para combinar datos de secuencia de lectura corta con datos de secuencia de lectura larga. [32] [33] En 2012, se publicaron varias publicaciones revisadas por pares que demostraban el acabado automatizado de los genomas bacterianos, [34] [35] incluido un artículo que actualizó el Celera Assembler con un proceso para el acabado del genoma utilizando lecturas de secuenciación SMRT largas. [36] En 2013, los científicos estimaron que la secuenciación de lectura larga podría usarse para ensamblar y terminar por completo la mayoría de los genomas bacterianos y arqueales. [37]
La misma molécula de ADN se puede volver a secuenciar de forma independiente creando la plantilla de ADN circular y utilizando una enzima que desplaza la hebra que separa la hebra de ADN recién sintetizada de la plantilla. [38] En agosto de 2012, científicos del Broad Institute publicaron una evaluación de la secuenciación SMRT para llamadas SNP. [39]
La dinámica de la polimerasa puede indicar si una base está metilada . [40] Los científicos demostraron el uso de secuenciación en tiempo real de una sola molécula para detectar metilación y otras modificaciones de bases. [41] [42] [43] En 2012, un equipo de científicos utilizó la secuenciación SMRT para generar los metilomas completos de seis bacterias. [44] En noviembre de 2012, los científicos publicaron un informe sobre la metilación en todo el genoma de una cepa epidémica de E. coli. [45]
Las lecturas largas permiten secuenciar isoformas genéticas completas, incluidos los extremos 5 'y 3'. Este tipo de secuenciación es útil para capturar isoformas y variantes de empalme. [46] [47]
La secuenciación SMRT tiene varias aplicaciones en la investigación de la genética médica reproductiva cuando se investigan familias con sospecha de mosaicismo gonadal parental. Las lecturas largas permiten la fase de haplotipos en pacientes para investigar el origen de las mutaciones. La secuenciación profunda permite la determinación de las frecuencias alélicas en los espermatozoides, de relevancia para la estimación del riesgo de recurrencia para la futura descendencia afectada. [48] [49]
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enlaces externos
- Informe de BioIT World.com
- Informe del New York Times