En biología molecular , un amplicón es un fragmento de ADN o ARN que es la fuente y / o producto de eventos de amplificación o replicación . Puede formarse artificialmente, utilizando varios métodos, incluidas las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) o las reacciones en cadena de la ligasa (LCR), o de forma natural mediante la duplicación de genes . En este contexto, la amplificación se refiere a la producción de una o más copias de un fragmento genético o secuencia diana, específicamente el amplicón. Como se refiere al producto de una reacción de amplificación, amplicón se usa indistintamente con términos comunes de laboratorio, como "producto de PCR".
La amplificación artificial se utiliza en investigación , [1] forense , [2] y medicina [1] con fines que incluyen la detección y cuantificación de agentes infecciosos , [3] identificación de restos humanos, [4] y extracción de genotipos del cabello humano. [2]
La duplicación genética natural juega un papel importante en la evolución . También está implicado en varias formas de cáncer humano, incluido el linfoma mediastínico primario de células B y el linfoma de Hodgkin . [5] En este contexto, el término amplicón puede referirse tanto a una sección de ADN cromosómico que ha sido extirpado, amplificado y reinsertado en otra parte del genoma , como a un fragmento de ADN extracromasómico conocido como doble minuto , cada uno de los cuales puede ser compuesto por uno o más genes . La amplificación de los genes codificados por estos amplicones generalmente aumenta la transcripción de esos genes y, en última instancia, el volumen de proteínas asociadas . [6]
Estructura
Los amplicones en general son secuencias genéticas de repetición directa (de cabeza a cola) o de repetición invertida (de cabeza a cabeza o de cola a cola), y pueden ser de estructura lineal o circular. [7] Los amplicones circulares consisten en duplicaciones invertidas imperfectas recocidas en un círculo [8] y se cree que surgen de amplicones lineales precursores. [9]
Durante la amplificación artificial, la longitud del amplicón viene determinada por los objetivos experimentales. [10]
Tecnología
El análisis de amplicones ha sido posible gracias al desarrollo de métodos de amplificación como la PCR , y cada vez más a través de tecnologías más baratas y de mayor rendimiento para la secuenciación de ADN o la secuenciación de próxima generación , como la secuenciación de semiconductores iónicos , conocida popularmente como la marca del desarrollador, Ion Torrent. [11]
Las tecnologías de secuenciación de ADN, como la secuenciación de próxima generación, han hecho posible el estudio de amplicones en biología y genética del genoma , incluida la investigación genética del cáncer , [12] la investigación filogenética y la genética humana . [13] Por ejemplo, utilizando el gen de ARNr 16S , que es parte de cada genoma bacteriano y de arqueas y está altamente conservado, las bacterias pueden clasificarse taxonómicamente mediante la comparación de la secuencia del amplicón con secuencias conocidas. Esto funciona de manera similar en el dominio fúngico con el gen ARNr 18S , así como en la región no codificante de ITS1 . [14]
Independientemente del enfoque utilizado para amplificar los amplicones, se debe utilizar alguna técnica para cuantificar el producto amplificado. [15] Generalmente, estas técnicas incorporan un paso de captura y un paso de detección, aunque la forma en que se incorporan estos pasos depende del ensayo individual .
Los ejemplos incluyen el Ensayo de monitorización Amplicor HIV-1 ( RT-PCR ), que tiene la capacidad de reconocer el VIH en plasma ; el VIH-1 QT ( NASBA ), que se utiliza para medir la carga viral plasmática mediante la amplificación de un segmento del ARN del VIH; y amplificación mediada por transcripción , que emplea un ensayo de protección de hibridación para distinguir las infecciones por Chlamydia trachomatis . [15] Varios pasos de detección y captura están involucrados en cada enfoque para evaluar el producto de amplificación o amplicón. Con la secuenciación de amplicones, se concatenan y secuencian el gran número de amplicones diferentes que resultan de la amplificación de una muestra habitual. Una vez realizada la clasificación de control de calidad mediante diferentes métodos, los recuentos de taxones idénticos representan su abundancia relativa en la muestra.
Aplicaciones
La PCR se puede utilizar para determinar el sexo a partir de una muestra de ADN humano. [16] Los loci de inserción del elemento Alu se seleccionan, amplifican y evalúan en términos del tamaño del fragmento. El ensayo de sexo utiliza AluSTXa para el cromosoma X , AluSTYa para el cromosoma Y , o tanto AluSTXa como AluSTYa, para reducir la posibilidad de error a una cantidad insignificante. El cromosoma insertado produce un gran fragmento cuando se amplifica la región homóloga . Los machos se distinguen por tener dos amplicones de ADN presentes, mientras que las hembras solo tienen un amplicón. El kit adaptado para llevar a cabo el método incluye un par de cebadores para amplificar el locus y opcionalmente reactivos de reacción en cadena de la polimerasa. [17]
La LCR se puede utilizar para diagnosticar la tuberculosis . [18] La secuencia que contiene el antígeno de la proteína B está dirigida por cuatro cebadores oligonucleotídicos, dos para la cadena con sentido y dos para la cadena antisentido . Los cebadores se unen uno al lado del otro, formando un segmento de ADN bicatenario que, una vez separado, puede servir como objetivo para futuras rondas de replicación. En este caso, el producto puede detectarse mediante el inmunoensayo enzimático de micropartículas (MEIA) .
Ver también
- ADN polimerasa
- Derretimiento de alta resolución
- Análisis de la curva de fusión
- Biología Molecular
Referencias
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Otras lecturas
- Leckie, Gregor W .; Lee, Helen H. (1995). "Pruebas de enfermedades infecciosas por reacción en cadena de la ligasa" . En Meyers, Robert A. (ed.). Biología molecular y biotecnología: una referencia de escritorio completa . Nueva York: Wiley. págs. 463–6. ISBN 978-0-471-18634-2.
enlaces externos
"¿Qué es un amplicón? Ver ejemplos de las diferentes aplicaciones" . Video de YouTube .