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El análisis de partículas individuales segmenta y promedia muchas partículas de una muestra, lo que permite que los algoritmos informáticos procesen las imágenes individuales en una imagen "representativa" combinada. Esto permite mejoras en la relación señal-ruido y se puede combinar con la deconvolución para proporcionar mejoras limitadas a la resolución espacial en la imagen.

El análisis de partículas individuales es un grupo de técnicas de procesamiento de imágenes computarizadas relacionadas que se utilizan para analizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). [1] Estos métodos se desarrollaron para mejorar y ampliar la información obtenible a partir de imágenes TEM de muestras de partículas, normalmente proteínas u otras entidades biológicas grandes como los virus . Las imágenes individuales de partículas teñidas o sin teñir son muy ruidosas y muy difíciles de interpretar. La combinación de varias imágenes digitalizadas de partículas similares juntas proporciona una imagen con características más fuertes y más fáciles de interpretar. Una extensión de esta técnica utiliza métodos de partículas individuales para construir una reconstrucción tridimensional.de la partícula. Usando microscopía crioelectrónica se ha hecho posible generar reconstrucciones con resolución subnanométrica y resolución casi atómica [2] [3] primero en el caso de virus altamente simétricos, y ahora también en proteínas asimétricas más pequeñas. [4] El análisis de partículas individuales también se puede realizar mediante ICP-MS.

Técnicas [ editar ]

El análisis de partículas individuales se puede realizar tanto en muestras CryoTEM teñidas negativamente como con hielo vítreo . Los métodos de análisis de partículas individuales dependen, en general, de que la muestra sea homogénea, aunque se están desarrollando técnicas para tratar la heterogeneidad conformacional .

Las imágenes (micrografías), en el pasado, se recolectaban en película y se digitalizaban usando escáneres de alta calidad o usando detectores CCD incorporados acoplados a una capa fosforescente. Ahora es común usar detectores de electrones directos para recolectar imágenes. El procesamiento de imágenes se lleva a cabo utilizando programas de software especializados (por ejemplo [5] ), que a menudo se ejecutan en clústeres de computadoras con múltiples procesadores . Dependiendo de la muestra o de los resultados deseados, se pueden realizar varios pasos de procesamiento bidimensional o tridimensional. Además, el análisis de partículas individuales también se puede realizar en un modo de partículas individuales utilizando una unidad ICP-MS.

Alineación y clasificación [ editar ]

Las muestras biológicas, y especialmente las muestras incrustadas en hielo vítreo delgado , son altamente sensibles a la radiación, por lo que solo se pueden usar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta dosis baja, así como las variaciones en la mancha de metal utilizada (si se usa), significa que las imágenes tienen un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se observa. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén en registro y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una relación señal / ruido más alta . Como el ruido se distribuye principalmente de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes solo se refuerzan las características constantes. Normalmente, la alineación óptima (una traduccióny una rotación en el plano) para mapear una imagen sobre otra se calcula mediante correlación cruzada .

Sin embargo, una micrografía a menudo contiene partículas en múltiples orientaciones y / o conformaciones diferentes, por lo que para obtener promedios de imágenes más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en múltiples conjuntos. Esto normalmente se lleva a cabo utilizando uno de varios algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariable y la clasificación jerárquica ascendente, o la agrupación de k- medias .

A menudo se utilizan conjuntos de datos de decenas de miles de imágenes de partículas, y para llegar a una solución óptima se utiliza un procedimiento iterativo de alineación y clasificación, mediante el cual se utilizan promedios de imágenes fuertes producidos por clasificación como imágenes de referencia para una alineación posterior de todo el conjunto de datos. .

Filtrado de imágenes [ editar ]

El filtrado de imágenes (filtrado de paso de banda ) se utiliza a menudo para reducir la influencia de la información de frecuencia espacial alta y / o baja en las imágenes, lo que puede afectar los resultados de los procedimientos de alineación y clasificación. Esto es particularmente útil en imágenes de tinciones negativas . Los algoritmos hacen uso de transformadas rápidas de Fourier ( FFT ), a menudo empleando máscaras de bordes suaves con forma gaussiana en el espacio recíproco para suprimir ciertos rangos de frecuencia. Los filtros de paso alto eliminan las frecuencias espaciales bajas (como los efectos de rampa o gradiente), dejando intactas las frecuencias más altas. Los filtros de paso bajo eliminan las características de alta frecuencia espacial y tienen un efecto de desenfoque en los detalles finos.

Función de transferencia de contraste [ editar ]

Debido a la naturaleza de la formación de imágenes en el microscopio electrónico, las imágenes TEM de campo brillante se obtienen utilizando un enfoque bajo significativo . Esto, junto con las características inherentes al sistema de lentes del microscopio, crea imágenes borrosas visibles como una función de dispersión puntual . Los efectos combinados de las condiciones de obtención de imágenes se conocen como función de transferencia de contraste (CTF) y se pueden aproximar matemáticamente como una función en el espacio recíproco. Las técnicas de procesamiento de imágenes especializadas, como el cambio de fase y la corrección de amplitud / filtrado de wiener, pueden corregir (al menos parcialmente [6] ) el CTF y permitir reconstrucciones de alta resolución.

Reconstrucción tridimensional [ editar ]

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión son proyecciones del objeto que muestran la distribución de densidad a través del objeto, similar a los rayos X médicos. Haciendo uso del teorema del corte de proyección, se puede generar una reconstrucción tridimensional del objeto combinando muchas imágenes (proyecciones 2D) del objeto tomadas desde una variedad de ángulos de visión. Las proteínas en el hielo vítreo adoptan idealmente una distribución aleatoria de orientaciones (o ángulos de visión), lo que permite una reconstrucción bastante isotrópica si se utiliza una gran cantidad de imágenes de partículas. Esto contrasta con la tomografía electrónica , donde los ángulos de visión son limitados debido a la geometría de la muestra / configuración de imagen, dando una reconstrucción anisotrópica .La retroproyección filtrada es un método comúnmente utilizado para generar reconstrucciones 3D en análisis de partículas individuales, aunque existen muchos algoritmos alternativos. [3]

Antes de poder realizar una reconstrucción, es necesario estimar la orientación del objeto en cada imagen. Se han desarrollado varios métodos para calcular los ángulos de Euler relativos de cada imagen. Algunos se basan en líneas comunes ( sinogramas y proyecciones 1D comunes ), otros utilizan algoritmos de coincidencia de proyección iterativa. Este último funciona comenzando con un modelo inicial 3D simple y de baja resolución y compara las imágenes experimentales con las proyecciones del modelo y crea un nuevo 3D para iniciar una solución.

También hay métodos disponibles para realizar reconstrucciones en 3D de muestras helicoidales (como el virus del mosaico del tabaco ), aprovechando la simetría helicoidal inherente . Para estas muestras se pueden utilizar tanto métodos espaciales reales (que tratan secciones de la hélice como partículas individuales) como métodos espaciales recíprocos (que utilizan patrones de difracción).

Métodos de inclinación [ editar ]

The specimen stage of the microscope can be tilted (typically along a single axis), allowing the single particle technique known as random conical tilt.[7] An area of the specimen is imaged at both zero and at high angle (~60-70 degrees) tilts, or in the case of the related method of orthogonal tilt reconstruction, +45 and −45 degrees. Pairs of particles corresponding to the same object at two different tilts (tilt pairs) are selected, and by following the parameters used in subsequent alignment and classification steps a three-dimensional reconstruction can be generated relatively easily. This is because the viewing angle (defined as three Euler angles) of each particle is known from the tilt geometry.

Las reconstrucciones 3D a partir de una inclinación cónica aleatoria adolecen de información faltante como resultado de un rango restringido de orientaciones. Conocido como el cono faltante (debido a la forma en el espacio recíproco), esto causa distorsiones en los mapas 3D. Sin embargo, el problema del cono faltante a menudo se puede superar combinando varias reconstrucciones de inclinación. Los métodos de inclinación son los más adecuados para muestras teñidas negativamente y se pueden usar para partículas que se adsorben a la película de soporte de carbono en orientaciones preferidas. El fenómeno conocido como movimiento de carga o inducido por haz hace que la recolección de imágenes de alta inclinación de muestras en hielo vítreo sea un desafío.

Visualización y ajuste de mapas [ editar ]

Se encuentran disponibles varios programas de software que permiten visualizar los mapas en 3D. Estos a menudo permiten al usuario acoplar manualmente coordenadas de proteínas (estructuras de cristalografía de rayos X o RMN) de subunidades en la densidad de electrones. Varios programas también pueden ajustar subunidades computacionalmente.

ICP-MS de una sola partícula [ editar ]

SP-ICP-MS (Single Particle-Induced Coupled Plasma-Mass Spectroscopy) is used in several areas where there is the possibility of detecting and quantifying suspended particles in samples of environmental fluids, assessing their migration, assessing the size of particles and their distribution, and also determining their stability in a given environment. Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (SP ICP-MS) was designed for particle suspensions in 2000 by Claude Degueldre. He first tested this new methodology at the Forel Institute of the University of Geneva and presented this new analytical approach at the 'Colloid 2oo2' symposium during the spring 2002 meeting of the EMRS, and in the proceedings in 2003[[8]]. This study presents the theory of SP ICP-MS and the results of tests carried out on clay particles (montmorillonite) as well as other suspensions of colloids. This method was then tested on thorium dioxide nanoparticles by Degueldre & Favarger (2004),[[9]] zirconium dioxide by Degueldre et al (2004)[[10]] and gold nanoparticles, which are used as a substrate in nanopharmacy, and published by Degueldre et al (2006).[[11]] Subsequently, the study of uranium dioxide nano- and micro-particles gave rise to a detailed publication, Ref. Degueldre et al (2006).[[12]] Since 2010 the interest for SP ICP-MS has exploded.

Examples[edit]

  • Important information on protein synthesis, ligand binding and RNA interaction can be obtained using this novel technique at medium resolutions of 7.5 to 25Å.[13]
  • Methanococcus maripaludis chaperonin,[14] reconstructed to 0.43 nanometer resolution.[15] This bacterial protein complex is a machine for folding other proteins, which get trapped within the shell.
  • Fatty acid synthase[16] from yeast at 0.59 nanometer resolution.[17] This huge enzyme complex is responsible for building the long chain fatty acids essential for cellular life.
  • A 0.33 nanometer reconstruction of Aquareovirus.[18][19] These viruses infect fish and other aquatic animals. The reconstruction has high enough resolution to have amino acid side chain densities easily visible.

Primary database[edit]

  • EM Data Bank (EM Data Bank)

References[edit]

  1. ^ Frank, Joachim (2006). Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies: visualization of biological molecules in their native state. Oxford: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-518218-7.[page needed]
  2. ^ Zhou ZH (abril de 2008). "Hacia la determinación estructural de resolución atómica por microscopía crioelectrónica de una sola partícula" . Opinión actual en biología estructural . 18 (2): 218-28. doi : 10.1016 / j.sbi.2008.03.004 . PMC 2714865 . PMID 18403197 .  
  3. ^ a b Wang Q, Matsui T, Domitrovic T, Zheng Y, Doerschuk PC, Johnson JE (March 2013). "Dynamics in cryo EM reconstructions visualized with maximum-likelihood derived variance maps". Journal of Structural Biology. 181 (3): 195–206. doi:10.1016/j.jsb.2012.11.005. PMC 3870017. PMID 23246781.
  4. ^ Bartesaghi, Alberto; Merk, Alan; Banerjee, Soojay; Matthies, Doreen; Wu, Xiongwu; Milne, Jacqueline L. S.; Subramaniam, Sriram (2015-06-05). "2.2 Å resolution CryoTEM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor". Science. 348 (6239): 1147–1151. Bibcode:2015Sci...348.1147B. doi:10.1126/science.aab1576. ISSN 1095-9203. PMC 6512338. PMID 25953817.
  5. ^ "送彩金38满100提现_无需申请自动送彩金【官网】".
  6. ^ Downing KH, Glaeser RM (August 2008). "Restoration of weak phase-contrast images recorded with a high degree of defocus: the "twin image" problem associated with CTF correction". Ultramicroscopy. 108 (9): 921–8. doi:10.1016/j.ultramic.2008.03.004. PMC 2694513. PMID 18508199.
  7. ^ Radermacher M, Wagenknecht T, Verschoor A, Frank J (May 1987). "Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli". Journal of Microscopy. 146 (Pt 2): 113–36. doi:10.1111/j.1365-2818.1987.tb01333.x. PMID 3302267.
  8. ^ C. Degueldre & P. -Y. Favarger, « Colloid analysis by single particle inductively coupled plasma-mass spectroscopy: a feasibility study », Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, symposium C of the E-MRS 2002 Spring Meeting in Strasbourg, France, vol. 217, no 1, 28 avril 2003, p. 137–142 (ISSN 0927-7757, DOI 10.1016/S0927-7757(02)00568-X)
  9. ^ C Degueldre et P. -Y Favarger, « Thorium colloid analysis by single particle inductively coupled plasma-mass spectrometry », Talanta, vol. 62, no 5, 19 avril 2004, p. 1051–1054 (ISSN 0039-9140, DOI 10.1016/j.talanta.2003.10.016
  10. ^ C. Degueldre, P. -Y. Favarger et C. Bitea, « Zirconia colloid analysis by single particle inductively coupled plasma–mass spectrometry », Analytica Chimica Acta, vol. 518, no 1, 2 août 2004, p. 137–142 (ISSN 0003-2670, DOI 10.1016/j.aca.2004.04.015)
  11. ^ C. Degueldre, P. -Y. Favarger et S. Wold, « Gold colloid analysis by inductively coupled plasma-mass spectrometry in a single particle mode », Analytica Chimica Acta, vol. 555, no 2, 12 janvier 2006, p. 263–268 (ISSN 0003-2670, DOI 10.1016/j.aca.2005.09.021)
  12. ^ C. Degueldre, P. -Y. Favarger, R. Rossé et S. Wold, « Uranium colloid analysis by single particle inductively coupled plasma-mass spectrometry », Talanta, vol. 68, no 3, 15 janvier 2006, p. 623–628 (ISSN 0039-9140, DOI 10.1016/j.talanta.2005.05.006,
  13. ^ Arias-Palomo E, Recuero-Checa MA, Bustelo XR, Llorca O (December 2007). "3D structure of Syk kinase determined by single-particle electron microscopy". Biochim. Biophys. Acta. 1774 (12): 1493–9. doi:10.1016/j.bbapap.2007.10.008. PMC 2186377. PMID 18021750.
  14. ^ Japanese Protein databank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5137
  15. ^ Zhang J, Baker ML, Schröder GF, et al. (January 2010). "Mechanism of folding chamber closure in a group II chaperonin". Nature. 463 (7279): 379–83. Bibcode:2010Natur.463..379Z. doi:10.1038/nature08701. PMC 2834796. PMID 20090755.
  16. ^ Japanese Protein databank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=1623
  17. ^ Gipson P, Mills DJ, Wouts R, Grininger M, Vonck J, Kühlbrandt W (May 2010). "Direct structural insight into the substrate-shuttling mechanism of yeast fatty acid synthase by electron cryomicroscopy". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20): 9164–9. Bibcode:2010PNAS..107.9164G. doi:10.1073/pnas.0913547107. PMC 2889056. PMID 20231485.
  18. ^ Japanese Protein databank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5160
  19. ^ Zhang X, Jin L, Fang Q, Hui WH, Zhou ZH (April 2010). "3.3 A cryo-EM structure of a nonenveloped virus reveals a priming mechanism for cell entry". Cell. 141 (3): 472–82. doi:10.1016/j.cell.2010.03.041. PMC 3422562. PMID 20398923.

External links[edit]

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