Análisis de partículas individuales
El análisis de partículas individuales es un grupo de técnicas de procesamiento de imágenes computarizadas relacionadas que se utilizan para analizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). [1] Estos métodos se desarrollaron para mejorar y ampliar la información obtenible a partir de imágenes TEM de muestras de partículas, normalmente proteínas u otras entidades biológicas grandes como los virus . Las imágenes individuales de partículas teñidas o sin teñir son muy ruidosas y muy difíciles de interpretar. La combinación de varias imágenes digitalizadas de partículas similares juntas proporciona una imagen con características más fuertes y más fáciles de interpretar. Una extensión de esta técnica utiliza métodos de partículas individuales para construir una reconstrucción tridimensional.de la partícula. Usando microscopía crioelectrónica se ha hecho posible generar reconstrucciones con resolución subnanométrica y resolución casi atómica [2] [3] primero en el caso de virus altamente simétricos y ahora también en proteínas asimétricas más pequeñas. [4] El análisis de partículas individuales también se puede realizar mediante espectroscopía de masas de plasma acoplado inducido (ICP-MS).
El análisis de partículas individuales se puede realizar tanto en muestras CryoTEM teñidas negativamente como con hielo vítreo incrustado . Los métodos de análisis de partículas individuales dependen, en general, de que la muestra sea homogénea, aunque se están desarrollando técnicas para tratar la heterogeneidad conformacional .
Las imágenes (micrografías) se toman con un microscopio electrónico usando detectores CCD acoplados a una capa fosforescente (en el pasado, en cambio, se recolectaban en una película y se digitalizaban usando escáneres de alta calidad). El procesamiento de imágenes se lleva a cabo mediante programas de software especializados , que a menudo se ejecutan en clústeres de computadoras con múltiples procesadores . Dependiendo de la muestra o de los resultados deseados, se pueden realizar varios pasos de procesamiento bidimensional o tridimensional.
Además, el análisis de partículas individuales también se puede realizar en un modo de partículas individuales utilizando una unidad ICP-MS.
Las muestras biológicas, y especialmente las muestras incrustadas en hielo vítreo delgado , son altamente sensibles a la radiación, por lo que solo se pueden usar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta dosis baja, así como las variaciones en la mancha de metal utilizada (si se usa) significa que las imágenes tienen un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se observa. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén en registro y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una relación señal / ruido más alta . Como el ruido se distribuye principalmente de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes solo se refuerzan las características constantes. Normalmente, la alineación óptima (una traduccióny una rotación en el plano) para mapear una imagen sobre otra se calcula mediante correlación cruzada .
Sin embargo, una micrografía a menudo contiene partículas en múltiples orientaciones y / o conformaciones diferentes, por lo que para obtener promedios de imágenes más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en múltiples conjuntos. Esto normalmente se lleva a cabo utilizando uno de varios algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariable y la clasificación jerárquica ascendente, o agrupación de k- medias .
