La proteasa TEV ( EC 3.4.22.44 , inclusión nuclear del virus del grabado del tabaco-una endopeptidasa ) es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia del virus del grabado del tabaco (TEV). [1] Es un miembro del clan PA de proteasas similares a quimotripsina . [2] Debido a su alta especificidad de secuencia, se utiliza con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión in vitro e in vivo . [3]
inclusión nuclear-una endopeptidasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 3.4.22.44 | |||||||
No CAS. | 139946-51-3 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
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MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
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Origen
El virus del grabado del tabaco codifica todo su genoma como una sola poliproteína masiva (350 kDa). Esta se escinde en unidades funcionales mediante las tres proteasas: proteasa P1 (1 sitio de escisión), proteasa de componente auxiliar (1 sitio de escisión) y proteasa TEV (7 sitios de escisión). [1] La proteasa TEV nativa también contiene un sitio de autoescisión interno. Este sitio se escinde lentamente para inactivar la enzima (se desconoce la razón fisiológica de esto).
Estructura y función
La estructura de la proteasa TEV se ha resuelto por cristalografía de rayos X . [4] Está compuesto por dos barriles β y una cola C-terminal flexible y muestra homología estructural con la superfamilia de proteasas de quimotripsina ( clan PA , familia C4 según la clasificación MEROPS ). [2] Aunque es homóloga a las serina proteasas celulares (como tripsina , elastasa , trombina , etc.), la proteasa TEV usa una cisteína como nucleófilo catalítico [5] (al igual que muchas otras proteasas virales).
La catálisis covalente se realiza con una tríada Asp-His-Cys , dividida entre los dos barriles (Asp en β1 e His y Cys en β2). [6] El sustrato se mantiene como una hoja β, formando una interacción antiparalela con la hendidura entre los barriles y una interacción paralela con la cola C-terminal. [7] Por lo tanto, la enzima forma un túnel de unión alrededor del sustrato y las interacciones de la cadena lateral controlan la especificidad. [4]
Especificidad
La secuencia de escisión nativa preferida se identificó en primer lugar examinando los sitios de corte en el sustrato de poliproteína nativa para determinar la secuencia recurrente. El consenso para estos sitios de corte nativos es ENLYFQ \ S donde '\' indica el enlace peptídico escindido . [8] Los residuos del sustrato se etiquetan como P6 a P1 antes del sitio de corte y P1 'después del sitio de corte. Los primeros trabajos también midieron la escisión de una serie de sustratos similares para caracterizar qué tan específica era la proteasa para la secuencia nativa. [9] [10]
Posteriormente, los estudios han utilizado la secuenciación de sustratos escindidos de un conjunto de secuencias aleatorias para determinar patrones de preferencia. [11] [12] Aunque ENLYFQ \ S es la secuencia óptima, la proteasa es activa en mayor o menor grado en una variedad de sustratos (es decir, muestra cierta promiscuidad de sustrato ). La escisión más alta es de secuencias más cercanas al consenso EXLYΦQ \ φ donde X es cualquier residuo, Φ es cualquier residuo hidrófobo grande o mediano y φ es cualquier residuo hidrófobo o polar pequeño. Aunque esta secuencia es la óptima, las secuencias con residuos desfavorecidos en algunas posiciones aún se pueden escindir si el resto de la secuencia es óptimo. [10] [12]
La especificidad está dotada por la gran área de contacto entre la enzima y el sustrato. Las proteasas como la tripsina tienen especificidad por un residuo antes y después del enlace escindido debido a una hendidura de unión poco profunda con solo uno o dos bolsillos que se unen a las cadenas laterales del sustrato. Por el contrario, las proteasas virales como la proteasa TEV tienen una cola C-terminal larga que cubre completamente el sustrato para crear un túnel de unión. Este túnel contiene un conjunto de bolsas de unión estrechas de modo que cada cadena lateral del péptido sustrato (P6 a P1 ') se une en un sitio complementario (S6 a S1'). [4]
En particular, la cadena lateral del péptido P6-Glu contacta con una red de tres enlaces de hidrógeno; P5-Asn apunta hacia el disolvente, sin realizar interacciones específicas (de ahí la ausencia de consenso de sustrato en esta posición); P4-Leu está enterrado en un bolsillo hidrofóbico; P3-Tyr se mantiene en un bolsillo hidrofóbico con un enlace de hidrógeno corto al final; P2-Phe también está rodeado de hidrófobos, incluida la cara de la tríada histidina; P1-Gln forma cuatro enlaces de hidrógeno; y P1'-Ser está sólo parcialmente encerrado en un surco hidrofóbico poco profundo. [4]
Como herramienta bioquímica
Uno de los principales usos de esta proteína es eliminar las etiquetas de afinidad de las proteínas de fusión recombinantes purificadas . El motivo del uso de la proteasa TEV como herramienta bioquímica es su alta especificidad de secuencia. Esta especificidad permite la escisión controlada de proteínas cuando la secuencia de preferencia se inserta en bucles flexibles. También lo hace relativamente no tóxico in vivo ya que la secuencia reconocida apenas se encuentra en las proteínas. [13]
Aunque el diseño racional ha tenido un éxito limitado en el cambio de la especificidad de la proteasa, la evolución dirigida se ha utilizado para cambiar el residuo preferido antes [14] o después [15] [16] del sitio de escisión.
Sin embargo, la proteasa TEV tiene limitaciones como herramienta bioquímica. Es propenso a la desactivación por auto-escisión (autólisis), aunque esto puede abolirse mediante una única mutación S219V en el sitio de escisión interno. [17] La proteasa expresada sola también es poco soluble; sin embargo, se han realizado varios intentos para mejorar su solubilidad a través de la evolución dirigida y el diseño computacional. También se ha demostrado que la expresión se puede mejorar mediante la fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), que actúa como socio potenciador de la solubilidad.
Se ha informado que la proteasa TEV muestra una pérdida de actividad de 10 veces a 4 ° C. [18] La proteasa TEV muestra pérdida de actividad a temperaturas superiores a 34 ° C. [19]
El peso molecular de esta enzima varía entre 25 y 27 kDa dependiendo de la construcción específica utilizada.
Referencias
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enlaces externos
- Poliproteína TEV en UniProt
- Proteasa TEV en MEROPS
- Preguntas frecuentes sobre TEV del Instituto Nacional del Cáncer