Una etiqueta de masa en tándem ( TMT ) es una etiqueta química que facilita la multiplexación de muestras en la cuantificación e identificación basada en espectrometría de masas (MS) de macromoléculas biológicas como proteínas , péptidos y ácidos nucleicos . TMT pertenece a una familia de reactivos denominados marcadores de masa isobárica que son un conjunto de moléculas con la misma masa, pero producen iones informadores de diferente masa después de la fragmentación. La relación relativa de los iones indicadores medidos representa la abundancia relativa de la molécula marcada, aunque la supresión de iones tiene un efecto perjudicial sobre la precisión. [1] [2]A pesar de estas complicaciones, se ha demostrado que la proteómica basada en TMT ofrece una mayor precisión que la cuantificación sin etiquetas . [3] Además de ayudar en la cuantificación de proteínas, las etiquetas TMT también pueden aumentar la sensibilidad de detección de ciertos analitos altamente hidrófilos, como los fosfopéptidos, en análisis RPLC- MS. [4]
Actualmente hay seis variedades de TMT disponibles: TMTzero, una estructura de núcleo no sustituida isotópicamente; TMTduplex, un par isobárico de etiquetas de masa con una única sustitución isotópica; [5] TMTsixplex, un conjunto isobárico de seis etiquetas de masa con cinco sustituciones isotópicas; [6] [se necesita fuente no primaria ] TMT 10-plex - un conjunto de 10 etiquetas de masa isotópica que usan la región informadora TMTsixplex, pero usan diferentes isótopos elementales para crear una diferencia de masa de 0.0063 Da, [7] [ no primario fuente necesaria ] TMTpro una versión de 16 plex con un reportero diferente y normalizador de masas que el TMT original, y TMTpro Zero.
Las etiquetas contienen cuatro regiones, a saber, una región informadora de masas (M), una región de enlace escindible (F), una región de normalización de masas (N) y un grupo reactivo de proteínas (R). Las estructuras químicas de todas las etiquetas son idénticas pero cada una contiene isótopos sustituidos en varias posiciones, de modo que las regiones informadora de masas y de normalización de masas tienen masas moleculares diferentes en cada etiqueta. Las regiones MFNR combinadas de las etiquetas tienen los mismos pesos moleculares totales y estructura de modo que durante la separación cromatográfica o electroforética y en el modo de MS simple, las moléculas marcadas con etiquetas diferentes son indistinguibles. Tras la fragmentación en modo MS / MS , la información de secuencia se obtiene a partir de la fragmentación delLa columna vertebral del péptido y los datos de cuantificación se obtienen simultáneamente a partir de la fragmentación de las etiquetas, dando lugar a iones indicadores de masa.
Las estructuras de las etiquetas TMT están disponibles públicamente a través de la base de datos unimod en unimod.org y, por lo tanto, el software de espectrometría de masas como Mascot puede contabilizar las masas de las etiquetas. Además, a partir de la versión 2.2, Mascot tiene la capacidad de cuantificar usando TMT y otras etiquetas de masa isobárica sin el uso de software adicional. Intuitivamente, la confianza asociada con una medición de proteína depende de la similitud de las proporciones de diferentes péptidos y el nivel de señal de estas mediciones. Ha surgido un enfoque matemáticamente riguroso llamado BACIQ, que integra intensidades de péptidos y concordancia de medición de péptidos en intervalos de confianza para las proporciones de proteínas. [8]El estándar TKO se puede utilizar para evaluar la interferencia [9] [se necesita fuente no primaria ]
Las etiquetas TMT se utilizan comúnmente para etiquetar muestras de igual abundancia. Sin embargo, si una de las muestras etiquetadas es más abundante, puede aumentar la sensibilidad del análisis para todas las muestras. [10] Estas muestras marcadas isobáricamente se denominan portadores isobáricos. Fueron introducidos para el análisis de proteínas unicelulares mediante espectrometría de masas, [11] y han encontrado muchas otras aplicaciones. [12]