La cuantificación sin etiquetas es un método en espectrometría de masas que tiene como objetivo determinar la cantidad relativa de proteínas en dos o más muestras biológicas . A diferencia de otros métodos para la cuantificación de proteínas , la cuantificación sin marcaje no utiliza un compuesto que contenga un isótopo estable para unirse químicamente a la proteína y, por tanto, marcarla. [1] [2]
Implementación
La cuantificación sin etiquetas puede basarse en la intensidad de la señal precursora o en el recuento espectral . El primer método es útil cuando se aplica a espectros de masas de alta precisión, como los obtenidos utilizando la nueva generación de tiempo de vuelo (ToF), resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier (FTICR) o analizadores de masas Orbitrap . El poder de alta resolución facilita la extracción de señales de péptidos en el nivel de MS 1 y, por lo tanto, desacopla la cuantificación del proceso de identificación. Por el contrario, el recuento espectral simplemente cuenta el número de espectros identificados para un péptido dado en diferentes muestras biológicas y luego integra los resultados de todos los péptidos medidos de las proteínas que se cuantifican.
El marco computacional del enfoque libre de etiquetas incluye la detección de péptidos, el emparejamiento de los péptidos correspondientes a través de múltiples datos de LC-MS, la selección de péptidos discriminatorios. [3] [4]
La espectrometría de expresión de proteínas intactas (IPEx) es un enfoque de cuantificación sin etiquetas en espectrometría de masas en desarrollo por el grupo de química analítica en el Centro de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para la Seguridad Alimentaria y la Nutrición Aplicada y en otros lugares. Las proteínas intactas se analizan mediante un instrumento LCMS , generalmente un tiempo de vuelo cuadrupolo en modo de perfil, y el perfil de proteína completo se determina y cuantifica utilizando software de reducción de datos. Los primeros resultados son muy alentadores. En un estudio, dos grupos de réplicas de tratamiento de muestras de mamíferos (diferentes organismos con historiales de tratamiento similares, pero no réplicas técnicas) muestran docenas de biomarcadores de proteínas de bajo CV, lo que sugiere que IPEx es una tecnología viable para estudiar la expresión de proteínas. [5]
Detectando péptidos
Normalmente, las señales de péptidos se detectan a nivel de MS1 y se distinguen del ruido químico a través de su patrón isotópico característico. A continuación, estos patrones se rastrean a través de la dimensión del tiempo de retención y se utilizan para reconstruir un perfil de elución cromatográfica de la masa de péptido monoisotópico. La corriente iónica total de la señal del péptido se integra luego y se usa como una medida cuantitativa de la concentración de péptido original. Para cada péptido detectado, primero se encuentran todos los picos isotópicos y luego se asigna el estado de carga.
La cuantificación sin etiqueta puede basarse en la intensidad de la señal del precursor y tiene problemas debido a la interferencia de aislamiento: en estudios de alto rendimiento, la identidad del ión precursor del péptido que se mide podría ser fácilmente un péptido completamente diferente con una relación m / z similar y que eluye en un marco de tiempo que se solapa con el del péptido anterior. El recuento espectral tiene problemas debido al hecho de que se identifican los péptidos, por lo que es necesario ejecutar un escaneo MS / MS adicional que lleva tiempo y, por lo tanto, reduce la resolución del experimento.
Coincidencia de péptidos correspondientes
A diferencia del etiquetado diferencial, cada muestra biológica debe medirse por separado en un experimento sin etiquetado. Las señales de péptido extraídas se mapean luego a través de pocas o múltiples mediciones de LC-MS usando sus coordenadas en las dimensiones de masa a carga y tiempo de retención. Los datos de los instrumentos de precisión de alta masa facilitan enormemente este proceso y aumentan la certeza de hacer coincidir las señales de péptido correctas entre los experimentos.
Claramente, el procesamiento diferencial de muestras biológicas hace necesario tener un estándar que pueda usarse para ajustar los resultados. Los péptidos que no se espera que cambien en sus niveles de expresión en diferentes muestras biológicas pueden usarse para este propósito. Sin embargo, no todos los péptidos se ionizan bien y, por lo tanto, la elección de los candidatos debe realizarse después de un estudio inicial que solo debe caracterizar el contenido de proteínas de las muestras biológicas que se investigarán.
Seleccionar péptidos discriminatorios
Por último, se utilizan métodos de normalización sofisticados para eliminar artefactos sistemáticos en los valores de intensidad del péptido entre las mediciones de LC-MS. Luego, los péptidos discriminatorios se identifican seleccionando los péptidos cuyas intensidades normalizadas son diferentes (por ejemplo, valor de p <0,05) entre múltiples grupos de muestras.
Además, los espectrómetros de masas híbridos más nuevos como LTQ OrbiTrap ofrecen la posibilidad de adquirir identificaciones de péptidos MS / MS en paralelo a la medición de alta precisión de masa de péptidos en el nivel MS1. Esto plantea el desafío computacional para el procesamiento y la integración de estas dos fuentes de información y ha llevado al desarrollo de nuevas y prometedoras estrategias de cuantificación.
Referencias
- ^ Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B (octubre de 2007). "Espectrometría de masas cuantitativa en proteómica: una revisión crítica" . Química analítica y bioanalítica . 389 (4): 1017–31. doi : 10.1007 / s00216-007-1486-6 . PMID 17668192 .
- ^ Asara JM, Christofk HR, Freimark LM, Cantley LC (marzo de 2008). "Un método de cuantificación sin etiqueta por MS / MS TIC en comparación con SILAC y recuento espectral en una pantalla proteómica" . Proteómica . 8 (5): 994–9. doi : 10.1002 / pmic.200700426 . PMID 18324724 .
- ^ Bridges SM, Magee GB, Wang N, Williams WP, Burgess SC, Nanduri B (2007). "ProtQuant: una herramienta para la cuantificación sin etiquetas de datos proteómicos MudPIT" . BMC Bioinformática . 8 Suppl 7: S24. doi : 10.1186 / 1471-2105-8-S7-S24 . PMC 2099493 . PMID 18047724 .
- ^ Lukas N. Mueller; et al. (2008). "Una evaluación de soluciones de software para el análisis de datos proteómicos cuantitativos basados en espectrometría de masas". Revista de investigación del proteoma . 7 (1): 51–61. CiteSeerX 10.1.1.336.4416 . doi : 10.1021 / pr700758r . PMID 18173218 .
- ^ Scholl, PF, Una estrategia de LC / MS de proteína intacta para el desarrollo de biomarcadores séricos: biomarcadores de la capacidad de respuesta hepática al tratamiento quimiopreventivo con el triterpenoide CDDO-Im , Resumen , TOA 8:35 am ASMS Conference, 2007.