La microscopía de reflexión interna total es una técnica de imagen óptica especializada para el seguimiento y la detección de objetos que utiliza la luz dispersada desde un campo evanescente en las proximidades de una interfaz dieléctrica . Sus ventajas son una alta relación señal-ruido y una alta resolución espacial en la dimensión vertical.
Fondo
La reflexión interna total de la luz ocurre en la interfaz entre materiales de diferentes índices de refracción en ángulos de incidencia mayores que el ángulo crítico ., dónde
y es el índice del medio incidente y el índice del medio de transmisión y se mide desde lo normal a la interfaz.
En condiciones de reflexión interna total, el campo electromagnético en el medio de transmisión adquiere la forma de una onda evanescente , cuya intensidad decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz de modo que,
con . Para fines prácticos, el medio de transmisión a menudo se elige como un fluido, generalmente agua, en el que se puede sumergir un objeto microscópico. Se espera que el objeto, cuando se acerca a la interfaz, difunda la luz proporcionalmente a la intensidad del campo en su altura.. [1] Dado que la profundidad de penetración del campo evanescente es del orden de cientos de nanómetros, esta técnica se encuentra entre las más sensibles para rastrear los desplazamientos en la dirección perpendicular a una superficie. [2]
Aplicaciones
Imagen
La región de excitación delgada de un campo evanescente permite la obtención de imágenes de campo amplio de un área de muestra seleccionada con una alta relación señal / ruido . Sin embargo, en lugar de depender de la dispersión óptica, a menudo se introducen fluoróforos en la muestra para una visualización más selectiva en aplicaciones biológicas. Esta popular técnica de obtención de imágenes se conoce como microscopía de fluorescencia de reflexión interna total .
Seguimiento de partículas
Usando una onda evanescente calibrada, [1] la posición de una partícula coloidal o una sonda microscópica se puede rastrear con precisión nanométrica al monitorear la intensidad de la luz dispersada a través de la reflexión interna total frustrada . Entonces se puede obtener la dinámica detallada de la sonda o partícula, ya sea en condiciones de equilibrio térmico o de no equilibrio.
Por ejemplo, al recopilar la distribución de probabilidad de posición independiente del tiempo de una partícula sonda en equilibrio térmico e invertir la distribución de Maxwell-Boltzmann ,
- ,
dónde es la función de partición , yla constante de Boltzmann , se puede obtener el perfil de energía potencial de las interacciones entre la partícula y una superficie. [3] De esta manera, se pueden detectar fuerzas sub-picoNewton. [4]
Por otro lado, la dinámica difusiva de una célula o un coloide se puede deducir de su posición en la serie temporal obtenida mediante TIRM u otro método de seguimiento de partículas . De esta manera se han estudiado los efectos de acoplamiento hidrodinámico que dan como resultado la difusión reducida de una partícula en las proximidades de una interfaz sólida. [5]
Ver también
Referencias
- ^ a b Prieve, Dennis C. y Nasser A. Frej. "Microscopía de reflexión interna total: una herramienta cuantitativa para la medición de fuerzas coloidales". Langmuir 6.2 (1990): 396 - 403.
- ^ Prieve, Dennis C. "Medición de fuerzas coloidales con TIRM". Advances in Colloid and Interface Science 82.1 (1999): 93-125.
- ^ Walz, John Y. "Medición de interacciones de partículas con microscopía de reflexión interna total". Opinión actual en ciencia coloidal e interfaz 2.6 (1997): 600-606.
- ^ Parpadeo, Scott G., Jennifer L. Tipa y Stacy G. Bike. "Cuantificar la repulsión de doble capa entre una esfera coloidal y una placa de vidrio utilizando microscopía de reflexión interna total". Revista de ciencia de interfaces y coloides 158.2 (1993): 317-325.
- ^ Bevan, Michael A. y Dennis C. Prieve. "Difusión obstaculizada de partículas coloidales muy cerca de una pared: revisada". The Journal of Chemical Physics 113.3 (2000): 1228-1236.