La microscopía de campo oscuro (también llamada microscopía de fondo oscuro ) describe métodos de microscopía , tanto en microscopía óptica como electrónica , que excluyen el haz no disperso de la imagen. Como resultado, el campo alrededor de la muestra (es decir, donde no hay muestra para dispersar el haz) es generalmente oscuro.
En los microscopios ópticos se debe utilizar una lente de condensador de campo oscuro , que dirige un cono de luz lejos de la lente del objetivo. Para maximizar el poder de recolección de luz dispersa de la lente del objetivo, se usa inmersión en aceite y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo debe ser menor que 1.0. Se pueden usar lentes de objetivo con un NA más alto, pero solo si tienen un diafragma ajustable, lo que reduce el NA. A menudo, estos objetivos tienen un NA que varía de 0,7 a 1,25. [1]
Aplicaciones de microscopía óptica
En microscopía óptica , el campo oscuro describe una técnica de iluminación utilizada para mejorar el contraste en muestras sin teñir . Funciona iluminando la muestra con luz que no será captada por la lente del objetivo y por tanto no formará parte de la imagen. Esto produce la apariencia clásica de un fondo oscuro, casi negro, con objetos brillantes.
El camino de la luz
Los pasos se ilustran en la figura donde se utiliza un microscopio invertido .
- La luz entra en el microscopio para iluminar la muestra.
- Un disco de tamaño especial, el parche de parada (ver figura), bloquea algo de luz de la fuente de luz, dejando un anillo exterior de iluminación. También se puede sustituir razonablemente un anillo de fase ancho con un aumento reducido.
- La lente del condensador enfoca la luz hacia la muestra.
- La luz entra en la muestra. La mayoría se transmite directamente, mientras que parte se dispersa de la muestra.
- La luz dispersa entra en la lente del objetivo, mientras que la luz transmitida directamente simplemente no llega a la lente y no se recoge debido a un bloqueo de iluminación directa (ver figura).
- Solo la luz dispersa se enciende para producir la imagen, mientras que se omite la luz transmitida directamente.
Ventajas y desventajas
La microscopía de campo oscuro es una técnica muy simple pero efectiva y muy adecuada para usos que involucran muestras biológicas vivas y no teñidas , como un frotis de un cultivo de tejidos o de organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Teniendo en cuenta la simplicidad de la configuración, la calidad de las imágenes obtenidas con esta técnica es impresionante.
Una limitación de la microscopía de campo oscuro son los bajos niveles de luz que se ven en la imagen final. Esto significa que la muestra debe estar muy iluminada, lo que puede dañar la muestra.
Las técnicas de microscopía de campo oscuro están casi completamente libres de artefactos de estilo de halo o relieve típicos de la DIC y las imágenes de contraste de fase. Esto se produce a expensas de la sensibilidad a la información de fase.
La interpretación de imágenes de campo oscuro debe hacerse con mucho cuidado, ya que las características oscuras comunes de las imágenes de microscopía de campo claro pueden ser invisibles y viceversa. En general, la imagen de campo oscuro carece de las bajas frecuencias espaciales asociadas con la imagen de campo claro, lo que hace que la imagen sea una versión de alto nivel de la estructura subyacente.
Si bien la imagen de campo oscuro puede parecer primero un negativo de la imagen de campo claro, en cada una de ellas se ven diferentes efectos. En la microscopía de campo claro, las características son visibles cuando la luz incidente proyecta una sombra sobre la superficie o una parte de la superficie es menos reflectante, posiblemente por la presencia de picaduras o arañazos. Las características elevadas que son demasiado suaves para proyectar sombras no aparecerán en las imágenes de campo claro, pero la luz que se refleja en los lados de la característica será visible en las imágenes de campo oscuro.
- Comparación de las técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú (1,559 μm / píxel cuando se ve a resolución completa)
Iluminación de campo oscuro, el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra
Iluminación de campo brillante , el contraste de la muestra proviene de la atenuación de la luz en la muestra
Iluminación de luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra
Iluminación de contraste de fase, el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra
Uso en informática
La microscopía de campo oscuro se ha aplicado recientemente en dispositivos señaladores de mouse de computadora para permitir que el mouse trabaje en vidrio transparente mediante la obtención de imágenes de defectos microscópicos y polvo en la superficie del vidrio.
Microscopía de campo oscuro combinada con imágenes hiperespectrales
Cuando se combina con imágenes hiperespectrales , la microscopía de campo oscuro se convierte en una herramienta poderosa para la caracterización de nanomateriales incrustados en células. En una publicación reciente, Patskovsky et al. utilizó esta técnica para estudiar la unión de nanopartículas de oro (AuNP) dirigidas a las células cancerosas CD44 +. [2]
Aplicaciones del microscopio electrónico de transmisión
Los estudios de campo oscuro en microscopía electrónica de transmisión juegan un papel importante en el estudio de cristales y defectos de cristales, así como en la formación de imágenes de átomos individuales.
Imágenes convencionales de campo oscuro
Brevemente, la formación de imágenes [3] implica inclinar la iluminación incidente hasta que un haz difractado, en lugar del incidente, pase a través de una pequeña apertura del objetivo en el plano focal posterior de la lente del objetivo. Las imágenes de campo oscuro, bajo estas condiciones, permiten mapear la intensidad difractada proveniente de una única colección de planos difractantes en función de la posición proyectada en la muestra y en función de la inclinación de la muestra.
En las muestras de monocristal, las imágenes de campo oscuro de reflexión simple de una muestra inclinada justo fuera de la condición de Bragg permiten "iluminar" solo los defectos de la red, como dislocaciones o precipitados, que curvan un solo conjunto de planos de red en su vecindad. . El análisis de intensidades en tales imágenes se puede utilizar para estimar la cantidad de curvatura. En las muestras policristalinas, por otro lado, las imágenes de campo oscuro sirven para iluminar solo el subconjunto de cristales que se reflejan en Bragg en una orientación determinada.
| Animación: imágenes de cristales en campo oscuro |
|---|
 Simulación digital de campo oscuro de partículas metálicas de 2 nm en un nanocilindro |
Imágenes de haz débil
La formación de imágenes de haz débil implica una óptica similar a la del campo oscuro convencional, pero utiliza un haz armónico difractado en lugar del haz difractado en sí. De esta forma, se puede obtener una resolución mucho mayor de las regiones deformadas alrededor de los defectos.
Imágenes anulares de campo oscuro de ángulo bajo y alto
Las imágenes anulares de campo oscuro requieren que uno forme imágenes con electrones difractados en una apertura anular centrada en el haz no disperso, pero sin incluirlo. Para ángulos de dispersión grandes en un microscopio electrónico de transmisión de barrido , esto a veces se denomina imagen de contraste Z debido a la dispersión mejorada de los átomos de alto número atómico.
Análisis digital de campo oscuro
Se trata de una técnica matemática intermedia entre el espacio directo y el recíproco (transformada de Fourier) para explorar imágenes con periodicidades bien definidas, como las imágenes en celosía-franja de microscopio electrónico. Al igual que con las imágenes analógicas de campo oscuro en un microscopio electrónico de transmisión, permite "iluminar" los objetos en el campo de visión donde residen las periodicidades de interés. A diferencia de las imágenes analógicas de campo oscuro, también puede permitir mapear la fase de Fourier de las periodicidades y, por lo tanto, los gradientes de fase, que proporcionan información cuantitativa sobre la deformación de la red vectorial.
Ver también
Notas al pie
- ^ Nikon: Iluminación de campo oscuro
- ^ S. Patskovsky; et al. (2014). "Imagen 3D hiperespectral de campo amplio de nanopartículas de oro funcionalizadas dirigidas a células cancerosas mediante microscopía de luz reflejada". Revista de biofotónica . 8 (5): 1–7. doi : 10.1002 / jbio.201400025 . PMID 24961507 .
- ^ P. Hirsch, A. Howie, R. Nicholson, DW Pashley y MJ Whelan (1965/1977) Microscopía electrónica de cristales delgados (Butterworths / Krieger, Londres / Malabar FL) ISBN 0-88275-376-2 .
enlaces externos
- Nikon - Estereomicroscopía> Iluminación de campo oscuro
- Expresiones moleculares
- Imprimación de iluminación de campo oscuro
- Gage SH . 1920. Microscopía moderna de campo oscuro e historia de su desarrollo . Transacciones de la American Microscopical Society 39 (2): 95-141.
- Microscopios de campo oscuro y contraste de fase (Université Paris Sud)