Los experimentos de triple resonancia son un conjunto de experimentos multidimensionales de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) que vinculan tres tipos de núcleos atómicos , que generalmente consisten en 1 H, 15 N y 13 C. Estos experimentos se utilizan a menudo para asignar señales de resonancia específicas a átomos específicos en una proteína enriquecida isotópicamente. La técnica fue descrita por primera vez en artículos por Ad Bax , Mitsuhiko Ikura y Lewis Kay en 1990, [1] [2]y luego se agregaron más experimentos al conjunto de experimentos. Muchos de estos experimentos se han convertido desde entonces en el conjunto estándar de experimentos utilizados para la asignación secuencial de resonancias de RMN en la determinación de la estructura de la proteína por RMN . Ahora son una parte integral del estudio de RMN en solución de proteínas, y también pueden usarse en RMN de estado sólido . [3] [4]
Fondo
Hay dos métodos principales para determinar la estructura de las proteínas a nivel atómico. El primero de ellos es por cristalografía de rayos X , a partir de 1958 cuando se determinó la estructura cristalina de la mioglobina . El segundo método es por RMN, que comenzó en la década de 1980 cuando Kurt Wüthrich describió el marco para la determinación de la estructura de RMN de proteínas y resolvió la estructura de proteínas globulares pequeñas. [5] El primer método de determinación estructural de proteínas por RMN se basó en la espectroscopia de RMN homonuclear basada en protones en la que el tamaño de la proteína que se puede determinar se limita a ~ 10 KDa. Esta limitación se debe a la necesidad de asignar señales de RMN de la gran cantidad de núcleos en la proteína; en una proteína más grande, la mayor cantidad de núcleos da como resultado la sobrepoblación de resonancias, y el tamaño creciente de la proteína también amplía las señales, haciendo resonancia. tarea difícil. Estos problemas pueden aliviarse utilizando espectroscopía de RMN heteronuclear que permite editar el espectro de protones con respecto a los desplazamientos químicos de 15 N y 13 C , y también reduce la superposición de resonancias aumentando el número de dimensiones del espectro. En 1990, Ad Bax y sus colaboradores desarrollaron la tecnología de triple resonancia y realizaron experimentos con proteínas marcadas isotópicamente con 15 N y 13 C, [1] con el resultado de que los espectros se simplificaron drásticamente, lo que facilitó enormemente el proceso de asignación de resonancia y aumentó el tamaño. de la proteína que puede determinarse por RMN.
Estos experimentos de triple resonancia utilizan los acoplamientos magnéticos relativamente grandes entre ciertos pares de núcleos para establecer su conectividad. Específicamente, los acoplamientos 1 J NH , 1 J CH , 1 J CC y 1 J CN se utilizan para establecer la ruta de conectividad escalar entre núcleos. El proceso de transferencia de magnetización se lleva a cabo a través de múltiples y eficientes pasos de transferencia de magnetización de un enlace, en lugar de un solo paso a través de los acoplamientos 3 J HH más pequeños y variables . El tamaño relativamente grande y la buena uniformidad de los acoplamientos de un enlace permitieron el diseño de esquemas de transferencia de magnetización eficientes que son efectivamente uniformes en una proteína dada, casi independientes de la conformación. [3] Los experimentos de triple resonancia con 31 P también se pueden utilizar para estudios de ácidos nucleicos. [6]
Suite de experimentos
Estos experimentos generalmente se nombran por los núcleos (H, N y C) involucrados en el experimento. CO se refiere al carbono carbonilo , mientras que CA y CB se refieren a Cα y Cβ respectivamente, de manera similar HA y HB para Hα y Hβ (ver diagrama para ejemplos de experimentos). Los núcleos en el nombre están ordenados en la misma secuencia que en la ruta de transferencia de magnetización, los núcleos colocados entre paréntesis están involucrados en la ruta de transferencia de magnetización pero no se registran. Por razones de sensibilidad, estos experimentos generalmente comienzan en un protón y terminan en un protón, generalmente a través de INEPT y pasos INEPT inversos. Por lo tanto, muchos de estos experimentos son lo que se puede llamar experimentos de "ida y vuelta" en los que, aunque no se indica en el nombre, la magnetización se transfiere de nuevo al protón inicial para la adquisición de la señal.
Algunos de los experimentos se utilizan en conjunto para la asignación de resonancia de proteínas, por ejemplo, HNCACB se puede utilizar junto con CBCA (CO) NH como un par de experimentos. No es necesario registrar todos estos experimentos para la asignación secuencial (se puede hacer con tan solo dos); sin embargo, los pares de experimentos adicionales son útiles para la evaluación independiente de la exactitud de la asignación, y la redundancia de información puede ser necesaria cuando hay ambigüedad en las asignaciones. También son necesarios otros experimentos para asignar completamente las resonancias de la cadena lateral.
Existen versiones TROSY de muchos de estos experimentos para mejorar la sensibilidad. [7] Los experimentos de triple resonancia también se pueden utilizar en la asignación de resonancia de la columna vertebral específica de secuencia de espectros de RMN de giro de ángulo mágico en RMN de estado sólido . [4] [8]
Se ha creado un gran número de experimentos de RMN de triple resonancia, y los experimentos que se enumeran a continuación no pretenden ser exhaustivos.
HNCO
El experimento proporciona las conectividades entre la amida de un residuo con el carbono carbonilo de los residuos precedentes. [2] Es el más sensible de los experimentos de triple resonancia. Las cadenas laterales carboxamidas de asparagina y glutamina también son visibles en este experimento. Además, el grupo guanidino de la arginina , que tiene una constante de acoplamiento similar al grupo carboxamida, también puede aparecer en este espectro. Este experimento a veces se usa junto con HN (CA) CO.
HN (CA) CO
Aquí, la resonancia de amida de un residuo se correlaciona con el carbono carbonilo del mismo residuo, así como con el del residuo anterior. Las resonancias intrarresiduos suelen ser más fuertes que las entre restos. [9]
HN (CO) CA
Este experimento correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con el Cα del residuo anterior. Este experimento se usa a menudo junto con HNCA. [10]
HNCA
Este experimento correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo, el Cα del mismo residuo, así como los del residuo anterior. [2] Cada tira da dos picos, los picos de Cα inter e intra-residuo. El pico del Cα precedente puede identificarse a partir del experimento de HN (CO) CA que da solo el Cα entre residuos.
CBCA (CO) NH
CBCA (CO) NH, o alternativamente HN (CO) CACB, correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con el Cα y Cβ del residuo anterior. [11] Por tanto, dos picos correspondientes a Cα y Cβ son visibles para cada residuo. Este experimento se usa normalmente junto con HNCACB. La carboxamida de cadena lateral de glutaminas y asparaginas también aparece en este espectro en este experimento. CBCA (CO) NH a veces se denomina con más precisión (HBHA) CBCA (CO) NH, ya que comienza con protones alifáticos y termina en un protón de amida y, por lo tanto, no es un experimento de ida y vuelta como HN (CO) CACB.
HNCACB
HNCACB, o alternativamente CBCANH, correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo Cα y Cβ del mismo residuo así como los del residuo anterior. [12] En cada tira, pueden verse cuatro picos: 2 del mismo residuo y 2 del residuo anterior. Los picos del residuo anterior suelen ser más débiles y pueden identificarse utilizando CBCA (CO) NH. En este experimento, los picos de Cα y Cβ están en fase opuesta, es decir, si Cα aparece como un pico positivo, entonces Cβ será negativo, lo que facilita la identificación de Cα y Cβ. La información adicional de Cβ del conjunto de experimentos CBCA (CO) NH / HNCACB facilita la identificación del tipo de residuo que HN (CO) CA / HNCA; sin embargo, el HNCACB es un experimento menos sensible y puede ser inadecuado para algunas proteínas.
El experimento CBCANH es menos adecuado para proteínas más grandes, ya que es más susceptible al problema del ancho de línea que HNCACB.
CBCACO (CA) HA
Este experimento proporciona las conectividades entre Cα y Cβ con los átomos de carbono carbonilo y Hα dentro del mismo residuo. [13] El grupo carboxilo de cadena lateral de aspartato y glutamato puede aparecer débilmente en este espectro.
CC (CO) NH
Este experimento proporciona conectividades entre la amida de un residuo y los átomos de carbono alifáticos del residuo anterior. [14]
H (CCO) NH
Este experimento proporciona conectividades entre la amida de un residuo y los átomos de hidrógeno unidos al carbono alifático del residuo anterior.
HBHA (CO) NH
Este experimento correlaciona la resonancia de amida con el Hα y Hβ del residuo anterior. [15]
Asignación secuencial
Los pares de experimentos se utilizan normalmente para la asignación secuencial, por ejemplo, el par HNCACB y CBCA (CO) NH, o HNCA y HNC (CO) CA. Los espectros se analizan normalmente como tiras de picos, y las tiras del par de experimentos pueden presentarse juntas una al lado de la otra o como una superposición de dos espectros. En los espectros HNCACB, normalmente están presentes 4 picos en cada tira, el Cα y Cβ de un residuo así como los de su residuo precedente. Los picos del residuo anterior se pueden identificar a partir del experimento CBCA (CO) NH. Por lo tanto, cada tira de picos se puede unir a la siguiente tira de picos de un residuo contiguo, lo que permite que las tiras se conecten secuencialmente. El tipo de residuo se puede identificar a partir de los cambios químicos de los picos; algunos, como la serina, treonina, glicina y alanina, son mucho más fáciles de identificar que otros. Las resonancias se pueden asignar comparando la secuencia de picos con la secuencia de aminoácidos de la proteína.
Referencias
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enlaces externos
- Experimentos de triple resonancia para proteínas
- Introducción a los experimentos de triple resonancia 3D
- RMN de proteínas: una guía práctica