La ultramicrotomía es un método para cortar muestras en rebanadas extremadamente delgadas, llamadas secciones ultradelgadas, que se pueden estudiar y documentar con diferentes aumentos en un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Se utiliza principalmente para muestras biológicas, pero también se pueden preparar secciones de plásticos y metales blandos. Las secciones deben ser muy delgadas porque los electrones de 50 a 125 kV del microscopio electrónico estándar no pueden atravesar material biológico mucho más grueso que 150 nm. Para obtener las mejores resoluciones, las secciones deben ser de 30 a 60 nm. Esto es aproximadamente el equivalente a dividir un cabello humano de 0,1 mm de grosor en 2.000 cortes a lo largo de su diámetro, o cortar un solo glóbulo rojo en 100 cortes. [1]
Proceso de ultramicrotomía
Se cortan secciones ultradelgadas de muestras utilizando un instrumento especializado llamado "ultramicrotomo". El ultramicrotomo está equipado con un cuchillo de diamante, para la mayoría de los cortes biológicos ultrafinos, o con un cuchillo de vidrio, que se utiliza a menudo para los cortes iniciales. Hay muchos otros equipos involucrados en el proceso de ultramicrotomía. Antes de seleccionar un área del bloque de muestras para ser seccionada ultradelgada, el técnico examina secciones semifinas o "gruesas" en un rango de 0.5 a 2 μm. Estas secciones gruesas también se conocen como secciones de estudio y se observan con un microscopio óptico para determinar si el área correcta de la muestra está en una posición para la sección delgada. Las secciones "ultrafinas" de 50 a 100 nm de espesor se pueden ver en el TEM.
Las secciones de tejido obtenidas por ultramicrotomía se comprimen mediante la fuerza de corte del cuchillo. Además, la microscopía de interferencia de la superficie de corte de los bloques revela que las secciones a menudo no son planas. Con Epon o Vestopal como medio de inclusión, las crestas y valles no suelen superar los 0,5 μm de altura, es decir, 5-10 veces el grosor de las secciones ordinarias (1).
Se toma una pequeña muestra de la muestra que se va a investigar. Las muestras pueden ser de materia biológica, como tejido animal o vegetal, o de material inorgánico como roca, metal, cinta magnética, plástico, película, etc. [3] El bloque de muestra se recorta primero para crear una cara de bloque de 1 mm por 1 mm de tamaño. Se toman secciones "gruesas" (1 μm) para observarlas en un microscopio óptico . Se elige un área para seccionar para TEM y la cara del bloque se vuelve a recortar a un tamaño no mayor de 0,7 mm en un lado. Las caras de los bloques suelen tener forma cuadrada, trapezoidal, rectangular o triangular. Finalmente, se cortan secciones delgadas con un cuchillo de vidrio o diamante utilizando un ultramicrótomo y las secciones se dejan flotando en el agua que se mantiene en un bote o artesa. Luego, las secciones se recuperan de la superficie del agua y se montan en una rejilla de cobre , níquel , oro u otro metal. El espesor de sección ideal para microscopía electrónica de transmisión con voltajes de aceleración entre 50 kV y 120 kV es de aproximadamente 30 a 100 nm.
Avances
En 1952 Humberto Fernández Morán introdujo la crio ultramicrotomía , que es una técnica similar pero que se realiza a temperaturas bajo cero entre -20 y -150 ° C. La crio ultramicrotomía se puede utilizar para cortar muestras biológicas ultrafinas congeladas. Una de las ventajas sobre el proceso de ultramicrotomía más "tradicional" es la rapidez, ya que debería ser posible congelar y seccionar una muestra en 1 a 2 horas.
Referencias
- ^ " Microscopía electrónica ", capítulo 4, por John J. Bozzola y Lonnie Dee Russell
- ^ Kempf, Eugen Karl (1976). "Aumentos bajos: un área marginal de microscopía electrónica" (PDF) . Información de ZEISS . 21 (83): 57–60. ISSN 0174-5581 .
- ^ Micro Star Technologies, cuchillos de diamante
- Helander HF (1969). "Topografía superficial de secciones de ultramicrotomo". J Ultrastruct Res . 29 : 373–382. doi : 10.1016 / S0022-5320 (69) 90060-4 . PMID 4903906 .