La acetoacetato descarboxilasa ( AAD o ADC ) es una enzima involucrada tanto en la vía de producción de cuerpos cetónicos en humanos y otros mamíferos como en la solventogénesis en bacterias. La acetoacetato descarboxilasa juega un papel clave en la producción de solventes al catalizar la descarboxilación del acetoacetato, produciendo acetona y dióxido de carbono . [1]
Acetoacetato descarboxilasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 4.1.1.4 | |||||||
No CAS. | 9025-03-0 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
Ontología de genes | AmiGO / QuickGO | |||||||
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Esta enzima ha sido de particular interés porque es un ejemplo clásico de cómo los valores de pKa de los grupos ionizables en el sitio activo de la enzima pueden perturbarse significativamente. Específicamente, el valor de pKa de la lisina 115 en el sitio activo es inusualmente bajo, lo que permite la formación de un intermedio de base de Schiff y la catálisis. [2]
ácido acetoacético | Acetoacetato descarboxilasa | acetona | |
CO 2 | |||
Historia
La acetoacetato descarboxilasa es una enzima con importantes implicaciones históricas, específicamente en la Primera Guerra Mundial y en el establecimiento del estado de Israel . [3] Durante la guerra, los aliados necesitaban acetona pura como disolvente de la nitrocelulosa , un compuesto altamente inflamable que es el principal componente de la pólvora. [4] En 1916, el bioquímico y futuro primer presidente de Israel, Chaim Weizmann, fue el primero en aislar Clostridium acetobutylicum , una bacteria anaeróbica grampositiva en la que se encuentra la acetoacetato descarboxilasa. Weizmann pudo aprovechar la capacidad del organismo para producir acetona a partir del almidón para producir explosivos en masa durante la guerra. [3] Esto llevó a los gobiernos estadounidense y británico a instalar el proceso ideado por Chaim Weizmann en varias grandes plantas de Inglaterra, Francia, Canadá y Estados Unidos. A través de las contribuciones científicas de Weizmann en la Primera Guerra Mundial, se acercó a líderes británicos influyentes educándolos sobre sus creencias sionistas. [5] Uno de ellos fue Arthur Balfour, el hombre que dio nombre a la Declaración Balfour, el primer documento en el que se pronunció el apoyo británico al establecimiento de una patria judía.
La producción de acetona por bacterias clostridiales o que contienen acetoacetato descarboxilasa se utilizó en síntesis industriales a gran escala en la primera mitad del siglo XX. En la década de 1960, la industria reemplazó este proceso con síntesis químicas más eficientes y menos costosas de acetona a partir del petróleo y sus derivados. [6] Sin embargo, ha habido un creciente interés en la producción de acetona que es más respetuosa con el medio ambiente, lo que ha provocado un resurgimiento en la utilización de bacterias que contienen acetoacetato descarboxilasa. [7] De manera similar, la fermentación de isopropanol y butanol utilizando especies de clostridios también se está volviendo popular.
Estructura
La acetoacetato descarboxilasa es un complejo de 365 kDa con una estructura homododecamérica. [8] La estructura general consta de láminas β antiparalelas y un barril β central en forma de cono de siete hebras . El núcleo de este barril β rodea el sitio activo en cada protómero de la enzima. El sitio activo, que consta de residuos como Phe 27, Met97 y Tyr113 , es principalmente hidrófobo . Sin embargo, el sitio activo contiene dos residuos cargados: Arg29 y Glu76 .
Se cree que Arg29 juega un papel en la unión del sustrato, mientras que se cree que Glu76 juega un papel en la orientación del sitio activo para la catálisis. El ambiente hidrofóbico general del sitio activo juega un papel crítico en favorecer la forma de amina neutra de Lys115, un residuo clave involucrado en la formación de un intermedio de base de Schiff . Se cree que otro residuo de lisina importante, Lys116, juega un papel importante en el posicionamiento de Lys115 en el sitio activo. A través de enlaces de hidrógeno con Ser16 y Met210 , Lys116 posiciona a Lys115 en el bolsillo hidrofóbico del sitio activo para favorecer la forma de amina neutra.
Mecanismo de reacción
La acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum cataliza la descarboxilación de acetoacetato para producir acetona y dióxido de carbono (Figura 1). El mecanismo de reacción procede a través de la formación de un intermedio de base de Schiff , que se une covalentemente a la lisina 115 en el sitio activo. La primera línea de apoyo para este mecanismo provino de un experimento de radiomarcaje en el que los investigadores marcaron el grupo carbonilo del acetoacetato con 18 O y observaron que el intercambio de oxígeno con agua, utilizada como disolvente, es una parte necesaria del paso de descarboxilación. [9] Estos resultados respaldaron que el mecanismo procede a través de una base de Schiff intermedia entre el cetoácido y un residuo de aminoácido en la enzima.
La investigación adicional condujo al aislamiento de una secuencia peptídica del sitio activo y la identificación de la lisina del sitio activo, Lys115, que está involucrada en la formación del intermedio de base de Schiff. [2] [10] Además, experimentos posteriores llevaron al hallazgo de que la actividad máxima de la enzima ocurre a pH 5.95, lo que sugiere que el pK a del grupo ε-amonio de Lys115 está significativamente perturbado en el sitio activo. [2] Si el pK a no fuera perturbado hacia abajo, el residuo de lisina permanecería protonado como un catión de amonio, haciéndolo no reactivo para la adición nucleofílica necesaria para formar la base de Schiff.
Sobre la base de este hallazgo, Westheimer et al. midió directamente el pK a de Lys115 en el sitio activo usando 5-nitrosalicilaldehído (5-NSA). La reacción de 5-NSA con acetoacetato descarboxilasa y la posterior reducción de la base de Schiff resultante con borohidruro de sodio condujeron a la incorporación de una molécula informadora de 2-hidroxi-5-nitrobencilamino en el sitio activo (Figura 2). La titulación de la enzima con este grupo informador adjunto reveló que el pK a de Lys115 se reduce a 5,9 en el sitio activo. [12] Estos resultados fueron la base para la propuesta de que la perturbación en el pK a de Lys115 se debía a su proximidad al grupo ε-amonio cargado positivamente de Lys116 en el sitio activo. [2] Una carga positiva cercana podría causar repulsiones electrostáticas desfavorables que debilitan el enlace NH de Lys115. La propuesta de Westheimer et al. Fue apoyada además por estudios de mutagénesis dirigida al sitio . Cuando Lys116 se mutó a cisteína o asparagina , se encontró que el pK a de Lys115 estaba significativamente elevado a más de 9,2, lo que indica que Lys116 cargado positivamente juega un papel crítico en la determinación del pK a de Lys115. [2] Aunque una estructura cristalina aún no se resolvió para proporcionar evidencia estructural, esta propuesta fue ampliamente aceptada y citada como un ejemplo de libro de texto de cómo el sitio activo puede organizarse con precisión para perturbar un pK a y afectar la reactividad. [8]
En 2009, se resolvió una estructura cristalina de acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum , lo que permitió evaluar la propuesta de Westheimer et al. Desde una nueva perspectiva. A partir de la estructura cristalina, los investigadores encontraron que Lys 115 y Lys 116 están orientados en direcciones opuestas y separados por 14,8 Å (Figura 3). [8] Esta distancia hace que sea poco probable que la carga positiva de Lys116 pueda afectar el pK a de Lys115. En cambio, a través de enlaces de hidrógeno con Ser16 y Met210, Lys116 probablemente mantiene a Lys115 en posición en un bolsillo hidrofóbico del sitio activo. Este posicionamiento altera la estabilidad del catión de amonio protonado de Lys115, lo que sugiere que la perturbación de pK de Lys115 un se produce a través de un ' desolvatación efecto'.
Inactivación e inhibición
La acetoacetato descarboxilasa es inhibida por varios compuestos. El anhídrido acético realiza un ataque electrofílico sobre el residuo catalítico crítico, Lys115, de acetoacetato descarboxilasa para inactivar la enzima. [13] La tasa de inactivación se evaluó mediante la hidrólisis del sustrato sintético 2,4-dinitrofenil propionato a dinitrofenol por acetoacetato descarboxilasa. En presencia de anhídrido acético, la enzima se inactiva, incapaz de catalizar la reacción de hidrólisis de propionato de 2,4-dinitrofenilo a dinitrofenol. [14]
El acetonilsulfonato actúa como un inhibidor competitivo (K I = 8,0 mM) ya que imita las características del sustrato natural, acetoacetato (K M = 8,0 mM). [15] La versión monoaniónica del acetonilfosfonato también es un buen inhibidor (K I = 0,8 mM), más eficaz que el monoéster o dianión de acetonilfosfonato. [16] Estos hallazgos indican que el sitio activo es muy discriminatorio y estéricamente restringido.
El cianuro de hidrógeno parece ser un inhibidor no competitivo , que se combina con los compuestos base de Schiff formados en el sitio activo. [15] La adición de compuestos de carbonilo a la enzima, en presencia de cianuro de hidrógeno, aumenta la capacidad del cianuro de hidrógeno para inhibir la acetoacetato descarboxilasa, lo que sugiere que los compuestos de carbonilo forman fácilmente las bases de Schiff en el sitio activo. El cianuro de hidrógeno es más potente como inhibidor a pH 6, el pH óptimo para la enzima, lo que sugiere que el paso limitante de la catálisis es la formación del intermedio de base de Schiff.
Las beta-dicetonas parecen inhibir bien la acetoacetato descarboxilasa, pero lentamente. La acetoacetato descarboxilasa tiene una K M para acetoacetato de 7 × 10 −3 M, mientras que la enzima tiene una K I para benzoilacetona de 1,9 × 10 −6 M. [15] Lo más probable es que una enamina se forme tras la interacción de las beta-dicetonas con la enzima libre .
La reacción de acetoacetato descarboxilasa con p -cloromercurifenilsulfonato (CMS) da como resultado una disminución de la actividad catalítica con dos equivalentes de CMS por subunidad enzimática. [15] CMS interactúa con dos grupos sulfhidrilo ubicados en cada subunidad enzimática. Se produce una inactivación adicional tras la adición de un tercer equivalente de CMS por subunidad. La adición de cisteína libre a la enzima inhibida puede revertir la inhibición por CMS de la acetoacetato descarboxilasa.
Actividad en bacterias
Se ha encontrado y estudiado acetoacetato descarboxilasa en las siguientes bacterias además de Clostridium acetobutylicum :
- Bacillus polymyxa
- Chromobacterium violaceum
- Clostridium beijerinckii
- Clostridium cellulolyticum
- Pseudomonas putida
Actividad en humanos y mamíferos
Aunque esta enzima no se ha purificado a partir de tejido humano, se demostró que la actividad está presente en el suero sanguíneo humano. [17] [18]
En los seres humanos y otros mamíferos, la conversión de acetoacetato en acetona y dióxido de carbono por la acetoacetato descarboxilasa es un paso final irreversible en la vía del cuerpo cetónico que suministra al cuerpo una fuente secundaria de energía. [19] En el hígado, la acetil co-A formada a partir de grasas y lípidos se transforma en tres cuerpos cetónicos: acetona , acetoacetato y D-β-hidroxibutirato . El acetoacetato y el D-β-hidroxibutirato se exportan a tejidos no hepáticos, donde se vuelven a convertir en acetil-CoA y se utilizan como combustible. Por otro lado, la acetona y el dióxido de carbono se exhalan y no se permite que se acumulen en condiciones normales.
El acetoacetato y el D-β-hidroxibutirato se interconvierten libremente mediante la acción de la D-β-hidroxibutirato deshidrogenasa. [19] Posteriormente, una función de la acetoacetato descarboxilasa puede ser regular las concentraciones de los otros dos cuerpos cetónicos de 4 carbonos.
Significación clínica
La producción corporal de cetonas aumenta significativamente cuando la tasa de metabolismo de la glucosa es insuficiente para satisfacer las necesidades energéticas del cuerpo. Tales condiciones incluyen dietas cetogénicas altas en grasas , cetoacidosis diabética o inanición severa. [20]
Bajo niveles elevados de acetoacetato y D-β-hidroxibutirato, la acetoacetato descarboxilasa produce significativamente más acetona. La acetona es tóxica y puede acumularse en el cuerpo en estas condiciones. Los niveles elevados de acetona en el aliento humano se pueden utilizar para diagnosticar la diabetes. [20]
Referencias
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enlaces externos
- acetoacetato + descarboxilasa en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- EC 4.1.1.4
- Brenda: Entrada de acetoacetato descarboxilasa
- KEGG: Entrada de acetoacetato descarboxilasa
- InterPro: IPR010451 Acetoacetato descarboxilasa