La etiqueta de aldehído es una etiqueta de péptido corta que puede introducirse en proteínas de fusión y mediante el tratamiento posterior con la enzima generadora de formilglicina (FGE) se genera un grupo aldehído reactivo para un acoplamiento adicional. Dado que ya existe una variedad de reactivos específicos de aldehído disponibles comercialmente (como los reactivos aminooxi o hidrazida), las aplicaciones posibles son diversas e incluyen la conjugación de fluoróforos , glicanos , cadenas de PEG ( polietilenglicol ) o grupos reactivos para su posterior síntesis (ver aplicaciones ).
Desarrollo
La etiqueta de aldehído es una etiqueta de péptido artificial reconocida por la enzima generadora de formilglicina (FGE). La formilglicina es una glicina con un grupo formilo (-CHO, un aldehído) en el carbono α. El motivo sulfatasa es la base de la secuencia del péptido que da como resultado la conversión específica del sitio de una cisteína en un residuo de formilglicina. La etiqueta peptídica se diseñó después de estudios sobre secuencias reconocibles por FGE en sulfatasas de diferentes organismos. Carrico y col. descubrió una alta homología en el motivo sulfatasa en bacterias, arqueas y eucariotas. [1]
Los aldehídos y las cetonas encuentran uso como indicadores químicos debido a sus fuertes propiedades electrofílicas. Esto permite una reacción en condiciones suaves cuando se usa un compañero de acoplamiento nucleofílico fuerte. Normalmente, en la bioconjugación se utilizan hidrazidas y sondas aminooxi . Forman productos de adición estabilizados con grupos carbonilo que se favorecen en las condiciones fisiológicas de reacción. A pH neutro, el equilibrio de la formación de la base de Schiff se encuentra lejos del lado del reactivo. Para hacer más productos nombrados, los compuestos se utilizan para formar hidrazonas y oximas estables . Dado que el pH óptimo de 4 a 6 no se puede lograr agregando un catalizador debido a la toxicidad asociada, la reacción es lenta en las células vivas. Una constante de reacción típica es de 10 −4 a 10 −3 M −1 s −1 . [2]
Un grupo carbonilo se introduce en las proteínas como un indicador químico utilizando diferentes técnicas, incluidos métodos modernos como la supresión del codón de parada y la etiqueta de aldehído aquí discutida. [1] [3] Limitar el uso de aldehídos y cetonas es su bioortogonalidad restringida en ciertos ambientes celulares. Las limitaciones de los aldehídos y cetonas como indicadores químicos se deben a
- competencia con aldehídos o cetonas endógenos en metabolitos y cofactores. Pueden producirse rendimientos más bajos y especificidad deteriorada.
- reacciones secundarias como oxidación o adición no deseada de nucleófilos endógenos.
- conjunto restringido de sondas que forman productos suficientemente estables. [4] [5]
Por lo tanto, los aldehídos y las cetonas se utilizan mejor en compartimentos donde se reducen tales reacciones secundarias no deseadas. Para los experimentos con células vivas, las superficies celulares y el espacio extracelular son áreas típicas de campo. Sin embargo, una característica de los grupos carbonilo es la gran cantidad de reacciones orgánicas que los involucran como electrófilos. Algunas de estas reacciones se pueden convertir fácilmente en ligaduras para sondear aldehídos. Una reacción bastante exótica empleada recientemente para la bioconjugación por Agarwal et al. es la adaptación de la reacción de Pictet-Spengler como ligadura. La reacción se conoce a partir de las rutas biosintéticas de los productos naturales [6] y tiene la principal ventaja de que se forma un nuevo enlace carbono-carbono. Esto garantiza la estabilidad a largo plazo en comparación con los enlaces carbono-heteroátomo con la misma cinética de reacción. [7]
La modificación de la cisteína o, más raramente, la serina [8] por FGE es una modificación postraduccional bastante inusual y ya se descubrió a finales de la década de 1990. [9] La deficiencia de FGE conduce a una deficiencia general de sulfatasas funcionales debido a la falta de formación de α-formilglicina vital para que las sulfatasas realicen su función. La FGE es esencial para la modificación de proteínas y la necesidad de alta especificidad y tasa de conversión se da en el entorno nativo, lo que hace que esta reacción sea aplicable en biología química y sintética. [10]
Carrico y col. fue pionero en la inserción del péptido con motivo sulfatasa modificado en proteínas de interés en 2007. [11] Este uso de aldehídos y cetonas como indicador químico en aplicaciones bioortogonales se ha aplicado en el autoensamblaje de fármacos de lisis celular, [12] la orientación de proteínas, [13] [3] así como de glucanos [14] y la preparación de proteínas de fusión heterobifuncionales [15] desde entonces.
Codificar genéticamente la etiqueta de aldehído
La etiqueta de formilglicina o etiqueta de aldehído es una etiqueta de largo conveniente de 6 o 13 aminoácidos fusionada a una proteína de interés. La etiqueta de 6 mer representa la secuencia de consenso de núcleo pequeño y la etiqueta de 13 mer el motivo completo más largo. Los experimentos sobre la etiqueta de aldehído codificada genéticamente por Carrico et al. mostró claramente la alta eficiencia de conversión con solo la secuencia de consenso central presente. Se produjeron cuatro proteínas de forma recombinante en E. coli con una eficiencia del 86% para el motivo de longitud completa y> 90% de eficiencia para el 6-mer determinado por espectrometría de masas . [1] El tamaño de la secuencia es análogo al 6x His-Tag [16] de uso común y tiene la ventaja de que también se puede codificar genéticamente. La secuencia se reconoce en el ER únicamente en función de la secuencia primaria y, posteriormente, es el objetivo de FGE. [9] En particular, en la configuración de proteínas de expresión recombinantes en E. coli, una coexpresión de FGE exógena ayuda a la conversión completa, [1] aunque E. coli tiene actividad FGE endógena. [17] La introducción de una etiqueta de aldehído propuesta por Carrico et al. tiene un flujo de trabajo que consta de tres segmentos: A la expresión de la proteína de fusión, que lleva la etiqueta peptídica derivada del motivo sulfatasa, B la conversión enzimática de Cys en f (Gly) y C el sondeo bioorthogonal con hidrazidas o alcoxi aminas ( Figura 1 ).
Como se ve en la Fig. 1 , la etiqueta de aldehído diseñada consiste en seis aminoácidos. Se eligió un conjunto de organismos de todos los dominios de la vida y se determinó la homología de secuencia del motivo sulfatasa. La secuencia utilizada es el mejor consenso para las secuencias encontradas en bacterias, arqueas, gusanos y vertebrados superiores. [1]
FGE-mecanismo de conversión de cisteína-formilglicina
El mecanismo catalítico de FGE está bien estudiado. Se propone una reacción redox de varios pasos con una enzima covalente: sustrato intermedio. Se estudió el papel del residuo de cisteína en la conversión que se producía mediante la mutación de la cisteína en alanina. No se encontró conversión usando espectrometría de masas cuando se usó la etiqueta de péptido mutado. [1] El mecanismo muestra el importante papel del grupo tiol activo redox de la cisteína en la formación de f (Gly), como se ve en la Fig. 2 . El paso clave del ciclo catalítico es la monooxidación del residuo de cisteína de la enzima, formando un intermedio reactivo de ácido sulfénico . Posteriormente, el grupo hidroxilo se transfiere a la cisteína del sustrato y después de la eliminación β heteroanáloga de H2O, se forma un tioaldehído . Este compuesto es muy reactivo y se hidroliza fácilmente, liberando el aldehído y una molécula de H 2 S, [18] [19] [10]
Aplicaciones
La etiqueta de aldehído es una técnica que recientemente encontró una mayor aplicación debido a la introducción de indicadores químicos bioortogonales. Los agentes bioortogonales contienen grupos funcionales como azidas o ciclooctinas para el acoplamiento que no se encuentran naturalmente en la célula. Debido a su extrañeza, parecen inertes y no interrumpen el metabolismo nativo, [1] [5] [7] La figura 3 ofrece una descripción general de los posibles métodos de etiquetado para la formilglicina. Por ejemplo, se puede acoplar a sondas como biotina o una etiqueta de proteína como Flag que son útiles para la purificación y detección. [1] [20] Además, los fluoróforos se pueden conjugar directamente para obtener imágenes de células vivas. [21] La conjugación de cadenas de polietilenglicol (PEG) a posibles fármacos candidatos extiende la estabilidad frente a las proteasas en los fluidos corporales y al mismo tiempo reduce el aclaramiento renal y la inmunogenicidad. [1] La primera aplicación descrita aquí, se ocupa de la formación de conjugados proteína-proteína a través de sondas bioortogonales. [22] Dado que, estrictamente hablando, la etiqueta de aldehído no es un verdadero agente bioortogonal, ya que se puede encontrar en varios metabolitos, puede causar reacciones cruzadas durante el etiquetado de proteínas. [14] [22] Sin embargo, se pueden aplicar sondas bioortogonales de acoplamiento como azidas o ciclooctinas para superar este obstáculo. [22] Como segunda aplicación, aquí se presenta el acoplamiento de restos de glicanos a proteínas. Puede utilizarse en la estrategia de patrones de glicosilación introducidos químicamente. [23]
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Formación de conjugados proteína-proteína a través de la química de clic sin Cu
Hudak y col. exploró la estrategia de producir conjugados proteína-proteína con la ayuda de la etiqueta de aldehído. [22] Su objetivo era conectar la IgG humana de longitud completa (hIgG) con la hormona del crecimiento humano (hGH). Estos conjugados proteína-proteína pueden ser superiores a las proteínas monoméricas en términos de vida media en suero en terapias de proteínas y, además, tienen atractivas propiedades de unión dual. [23] Con el fin de lograr la fusión de proteínas, la etiqueta de aldehído de cinco residuos (CxPxR) no cooperó en hIgG y hGH. En hIgG, la etiqueta de aldehído se introdujo en los extremos C de las dos cadenas pesadas, dando como resultado dos posibles sitios de conjugación. Luego, FGE oxida el residuo de cisteína a formilglicina (fGly) durante la expresión de la proteína. Para los siguientes pasos de conjugación, se seleccionó la estrategia de la química de clic sin cobre. Se llevó a cabo una cicloadición 1,3-dipolar promovida por cepa de un ciclooctinas y una azida formando un enlace covalente (también denominado cicloadición azida-alquino libre de Cu). [22] Por tanto, las proteínas portadoras de aldehído reaccionan bajo la formación de oxima con diferentes enlazadores heterobifuncionales que llevan un residuo aminooxi en un extremo y una azida o ciclooctinas en el otro. Esto da como resultado la unión de hIgG a un enlazador que contiene una ciclooctina (aquí dibenzoazaciclooctina (DIBAC)) y hGH a un enlazador que tiene una función azida ( Fig .: 2A y B ). Las proteínas hGH e hIgG también se trataron con DIBAC-488, azida Alexa Fluor 647 y se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot para validar la formación de oxima. A continuación, los derivados de DIBAC-hIgG y azida-hGH se unen mediante química de clic sin Cu ( figura 2C ). Las proteínas de fusión resultantes se purificaron y analizaron mediante inmunotransferencia (ver Hudak et al. 2012 ).
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Las transferencias de Western se tiñeron primero con Ponceau y luego se incubaron con anticuerpos IgG contra hGH y posteriormente se trataron con α-mIgG HRP y α-hIgG 647 para su visualización. En el Western blot conjugado de hIgG-hGH (condiciones no reductoras), dos bandas separadas con diferentes pesos moleculares son visibles después de la inmunodetección. Estos pueden contribuir a la formación de hGH mono y bi-conjugada a hIgG.
Glicosilación química del fragmento Fc de IgG
La naturaleza ha perfeccionado la glicosilación de proteínas a través de una compleja interacción de enzimas y carbohidratos durante miles de años. Sin embargo, la glicosilación química sigue siendo un obstáculo debido a la difícil síntesis de glicanos en general. [24] La síntesis de derivados de carbohidratos puede ser lenta y tediosa. [25] No obstante, el interés en tecnologías para imitar estructuralmente la glicosilación de proteínas es una aplicación atractiva, ya que algunas funciones de las proteínas dependen únicamente del patrón del glicano adjunto. [26] El fragmento Fc del anticuerpo IgG, por ejemplo, es un homodímero con un sitio de N-glicosilación altamente conservado. Los restos de azúcar unidos modulan la unión a inmunorreceptores específicos, modificando así la función completa del anticuerpo. [27] [28]
Smith y col. demostrar la aplicación de la etiqueta de aldehído como un sitio de conjugación química para glicanos. [21] La secuencia de la etiqueta de aldehído no cooperó en la construcción Fc y se introdujo en células CHO (ovario de hámster chino). Como controles, se utilizaron construcciones génicas en las que el residuo de cisteína se mutó a una alanina. Después de la expresión, las proteínas Fc se purificaron usando una columna de agarosa de proteína A / G. La conversión en células CHO de cisteína a formilglicina se examinó usando aminooxi AlexaFluor 488 y la posterior SDS-PAGE. Sin embargo, el escaneo de fluorescencia no mostró marcaje de fluorescencia, es decir, no hubo formación de formilglicina por FGE endógeno en células CHO. Las proteínas inalteradas se trataron luego con FGE recombinante de Mycobacterium tuberculosis in vitro en el que el grupo aldehído se instaló con éxito en el sitio de glicosilación de Fc ( Fig. 3A ).
A continuación, se llevó a cabo la introducción de N-acetilglucosaamina (GlcNAc) a las proteínas marcadas con aldehído mediante la formación de oxima mediante el tratamiento con aminooxi GlcNAc (AO-GlcNAc) ( Fig. 3B ). La conjugación se confirmó mediante cromatografía líquida-ionización por electropulverización-espectrometría de masas (LC-ESI-MS) y transferencia de lectina con la aglutinina de germen de trigo que se une a GlcNAc unida a AlexaFluor 647. Después de introducir con éxito GlcNAc, el monómero se extendió con una estructura de glicano que contenía GlcNAc, manosa (Man) y galactosa (Gal) ( Fig. 3C ). Se utilizó una endoglucosidasa mutante EndoS (EndoS-D233Q) ya que es altamente específica para residuos de GlcNAc ligados a N de IgG Fc y no alarga los sitios Asn-GlcNAc en otras proteínas o en IgG desnaturalizadas. La formación del producto se controló de nuevo mediante LC-ESI-MS y sondeo de transferencia de lectina con la aglutinina de sambucus nigra que se une al ácido siálico unida al isotiocianato de fluoresceína.
Se logró una glicosilación química exitosa del fragmento de Fc IgG que se asemeja al patrón de glicosilación natural. El estudio discutido anteriormente se centró en el anticuerpo IgG, sin embargo, la aplicación de la etiqueta de aldehído para la conjugación de glucanos podría extenderse potencialmente a otras proteínas. [21]
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Referencias
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