Proteína de fusión

Este artículo trata sobre proteínas de fusión quiméricas. Para las proteínas implicadas en la fusión de membranas, consulte proteína de fusión de membranas .

Una proteína quimérica que incluye dos subunidades y una proteína enlazadora sintetizada mediante tecnología de fusión recombinante.

Las proteínas de fusión o quimérico (Ki-mir-ik) proteínas (literalmente, hechos de partes de diferentes fuentes) son proteínas creadas a través de la unión de dos o más genes que originalmente codifican para las proteínas separadas. La traducción de este gen de fusión da como resultado uno o varios polipéptidos con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales. Las proteínas de fusión recombinantes se crean artificialmente mediante tecnología de ADN recombinante para su uso en investigación biológica o terapéutica . Quimérico o quimera generalmente designan proteínas híbridas hechas de polipéptidosque tienen diferentes funciones o patrones físico-químicos. Las proteínas mutantes quiméricas se producen de forma natural cuando una mutación compleja , como una translocación cromosómica , una duplicación en tándem o una retrotransposición, crea una secuencia codificadora novedosa que contiene partes de las secuencias codificantes de dos genes diferentes. Las proteínas de fusión de origen natural se encuentran comúnmente en las células cancerosas, donde pueden funcionar como oncoproteínas . La proteína de fusión bcr-abl es un ejemplo bien conocido de proteína de fusión oncogénica y se considera que es el principal impulsor oncogénico de la leucemia mielógena crónica .

Funciones

Algunas proteínas de fusión combinan péptidos completos y, por tanto, contienen todos los dominios funcionales de las proteínas originales. Sin embargo, otras proteínas de fusión, especialmente las que se producen de forma natural, combinan solo porciones de secuencias codificantes y, por lo tanto, no mantienen las funciones originales de los genes parentales que las formaron.

Muchas fusiones de genes completos son completamente funcionales y aún pueden actuar para reemplazar los péptidos originales. Algunos, sin embargo, experimentan interacciones entre las dos proteínas que pueden modificar sus funciones. Más allá de estos efectos, algunas fusiones de genes pueden causar cambios regulatorios que alteran cuándo y dónde actúan estos genes. Para las fusiones parciales de genes , la mezcla de diferentes sitios activos y dominios de unión tiene el potencial de dar como resultado nuevas proteínas con funciones novedosas.

Proteína verde fluorescente (GFP) insertada en las neuronas de los gusanos Varbuss para rastrear el desarrollo neuronal.

Etiquetas de proteínas fluorescentes

La fusión de etiquetas fluorescentes con proteínas en una célula huésped es una técnica muy popular utilizada en la investigación de células y biología experimental para rastrear las interacciones de las proteínas en tiempo real. La primera etiqueta fluorescente, la proteína verde fluorescente (GFP), se aisló de Aequorea Victoria y todavía se utiliza con frecuencia en la investigación moderna. Las derivaciones más recientes incluyen proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFP), que se aislaron por primera vez de Anthozoa . El PCFP más utilizado es el Kaedeetiqueta fluorescente, pero el desarrollo de Kikume verde-rojo (KikGR) en 2005 ofrece una señal más brillante y una fotoconversión más eficiente. La ventaja de usar etiquetas fluorescentes PCFP es la capacidad de rastrear la interacción de las vías bioquímicas superpuestas en tiempo real. La etiqueta cambiará de color de verde a rojo una vez que la proteína alcance un punto de interés en la vía, y la proteína de color alternativo se puede monitorear a lo largo de la duración de la vía. Esta técnica es especialmente útil cuando se estudian las vías de reciclaje del receptor acoplado a proteína G (GPCR). Los destinos de los receptores de proteína G reciclados pueden enviarse a la membrana plasmática para ser reciclados, marcados con una etiqueta fluorescente verde o pueden enviarse a un lisosomapara la degradación, marcado por una etiqueta roja fluorescente. ^[1]

Fármacos proteicos quiméricos

Bocetos de anticuerpos monoclonales de ratón (arriba a la izquierda), quiméricos (arriba a la derecha) y humanizados (abajo a la izquierda). Las partes humanas se muestran en marrón y las partes no humanas en azul.

El propósito de crear proteínas de fusión en el desarrollo de fármacos es impartir propiedades de cada una de las proteínas "originales" a la proteína quimérica resultante. Actualmente se encuentran disponibles varios fármacos de proteínas quiméricas para uso médico.

Muchos fármacos de proteínas quiméricas son anticuerpos monoclonales cuya especificidad para una molécula diana se desarrolló utilizando ratones y, por tanto, inicialmente eran anticuerpos de "ratón". Como proteínas no humanas, los anticuerpos de ratón tienden a provocar una reacción inmunitaria si se administran a seres humanos. El proceso de quimerización implica manipular la sustitución de segmentos de la molécula de anticuerpo que la distinguen de un anticuerpo humano. Por ejemplo, se pueden introducir dominios constantes humanos , eliminando así la mayoría de las porciones potencialmente inmunogénicas del fármaco sin alterar su especificidad por la diana terapéutica pretendida. Nomenclatura de anticuerposindica este tipo de modificación insertando -xi- en el nombre no propietario (por ejemplo, abci- xi -mab ). Si partes de los dominios variables también se reemplazan por partes humanas, se obtienen anticuerpos humanizados . Aunque no es conceptualmente distinto de las quimeras, este tipo se indica usando -zu- como en dacli- zu -mab . Consulte la lista de anticuerpos monoclonales para ver más ejemplos.

Además de los anticuerpos quiméricos y humanizados, existen otros propósitos farmacéuticos para la creación de construcciones quiméricas. Etanercept , por ejemplo, es un bloqueador de TNFα creado mediante la combinación de un receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) con el segmento Fc de inmunoglobulina G 1 . El TNFR proporciona especificidad para la diana del fármaco y se cree que el segmento Fc del anticuerpo añade estabilidad y capacidad de administración del fármaco. ^[2] Las proteínas quiméricas adicionales utilizadas para aplicaciones terapéuticas incluyen:

• Aflibercept : proteína recombinante humana que ayuda en el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico resistente al oxaliplatino , la degeneración macular neovascular y el edema macular . ^[2]
• Rilonacept : reduce la inflamación al prevenir la activación de los receptores de IL-1 para tratar los síndromes periódicos asociados a la criopirina (CAPS). ^[2]
• Alefacept : Reguló las respuestas de las células T dirigiéndose selectivamente a las células T efectoras de memoria para tratar la psoriasis vulgar . ^[2]
• Romiplostim : un pepticuerpo que trata la trombocitopenia inmunitaria . ^[2]
• Abatacept / Belatacept : interfiere con la coestimulación de células T para tratar trastornos autoinmunes como artritis reumatoide , artritis psoriásica y psoriasis . ^[2]
• Denileukin-diftitox : trata el linfoma cutáneo . ^[2]

Tecnología recombinante

Fusión de dos genes (BCR-ABL) para codificar una proteína oncogénica recombinante.

Una proteína de fusión recombinante es una proteína creada mediante la ingeniería genética de un gen de fusión. Normalmente, esto implica eliminar el codón de terminación de una secuencia de ADNc que codifica la primera proteína y luego agregar la secuencia de ADNc de la segunda proteína en el marco mediante PCR de extensión por ligación o superposición . Esa secuencia de ADN luego será expresada por una célula como una sola proteína. La proteína se puede diseñar para incluir la secuencia completa de ambas proteínas originales, o solo una parte de cualquiera de ellas.

Si las dos entidades son proteínas, a menudo también se añaden péptidos enlazadores (o "espaciadores"), lo que hace más probable que las proteínas se plieguen de forma independiente y se comporten como se esperaba. Especialmente en el caso en el que los enlazadores permiten la purificación de proteínas , los enlazadores en fusiones de proteínas o péptidos a veces se diseñan con sitios de escisión para proteasas o agentes químicos que permiten la liberación de las dos proteínas separadas. Esta técnica se utiliza a menudo para la identificación y purificación de proteínas mediante la fusión de una proteína GST , un péptido FLAG o un péptido hexa-his (etiqueta 6xHis), que se puede aislar mediante cromatografía de afinidad con resinas de níquel o cobalto. Las proteínas quiméricas di o multiméricas se pueden fabricar a través deingeniería genética por fusión con las proteínas originales de los dominios peptídicos que inducen la di- o multimerización de proteínas artificiales (p. ej., cremalleras de estreptavidina o leucina ). Las proteínas de fusión también se pueden fabricar con toxinas o anticuerpos unidos a ellas para estudiar el desarrollo de la enfermedad. Se estudió el promotor de hidrogenasa, P _SH , construyendo una fusión de promotor de P _SH- gfp utilizando el gen indicador de la proteína verde fluorescente ( gfp) . ^[3]

Funcionalidad recombinante

Las nuevas tecnologías recombinantes han hecho posible mejorar el diseño de proteínas de fusión para su uso en campos tan diversos como la biodetección, la industria papelera y alimentaria y los productos biofarmacéuticos. Las mejoras recientes han implicado la fusión de péptidos individuales o fragmentos de proteínas a regiones de proteínas existentes, como los extremos N y C , y se sabe que aumentan las siguientes propiedades: ^[4]

• Eficiencia catalítica : la fusión de ciertos péptidos permite una mayor eficiencia catalítica al alterar la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína diana. ^[4]
• Solubilidad : un desafío común en el diseño de proteínas de fusión es el problema de la insolubilidad de las proteínas de fusión recién sintetizadas en el huésped recombinante, lo que conduce a una sobreagregación de la proteína diana en la célula. Se pueden añadir chaperonas moleculares que pueden ayudar en el plegamiento de proteínas, segregando mejor las interacciones hidrófobas e hidrófilas en el soluto para aumentar la solubilidad de las proteínas. ^[4]
• Termoestabilidad : Por lo general, se añaden péptidos singulares o fragmentos de proteína para reducir la flexibilidad del extremo N o C de la proteína diana, lo que refuerza la termoestabilidad y estabiliza el rango de pH . ^[4]
• Actividad enzimática: la fusión que implica la introducción de enlaces de hidrógeno puede usarse para expandir la actividad enzimática general. ^[4]
• Niveles de expresión: la adición de numerosos fragmentos de fusión, como la proteína de unión a maltosa (MBP) o la pequeña molécula similar a la ubiquitina ( SUMO ), sirven para mejorar la expresión enzimática y la secreción de la proteína diana. ^[4]
• Inmovilización: PHA sintasa, una enzima que permite la inmovilización de proteínas de interés, es una etiqueta de fusión importante en la investigación industrial. ^[4]
• Calidad del cristal: la calidad del cristal se puede mejorar agregando enlaces covalentes entre proteínas, lo que ayuda en las técnicas de determinación de la estructura. ^[4]

Diseño de proteína recombinante

Las primeras aplicaciones del diseño de proteínas recombinantes pueden documentarse en el uso de etiquetas de péptidos individuales para la purificación de proteínas en cromatografía de afinidad . Desde entonces, se han desarrollado una variedad de técnicas de diseño de proteínas de fusión para aplicaciones tan diversas como etiquetas de proteínas fluorescentes a fármacos de proteínas de fusión recombinantes. Tres técnicas de diseño comúnmente utilizadas incluyen fusión en tándem, inserción de dominio y conjugación postraduccional. ^[5]

Fusión en tándem

Las proteínas de interés simplemente se conectan de un extremo a otro mediante la fusión de los terminales N o C entre las proteínas. Esto proporciona una estructura de puente flexible que permite suficiente espacio entre los socios de fusión para garantizar un plegado adecuado . Sin embargo, los extremos N o C del péptido son a menudo componentes cruciales para obtener el patrón de plegado deseado para la proteína recombinante, lo que hace que la unión simple de un extremo a otro de los dominios sea ineficaz en este caso. Por esta razón, a menudo se necesita un conector de proteína para mantener la funcionalidad de los dominios de proteína de interés. ^[5]

Inserción de dominio

Esta técnica implica la fusión de dominios proteicos consecutivos codificando las estructuras deseadas en una única cadena polipeptídica, pero a veces puede requerir la inserción de un dominio dentro de otro dominio. Esta técnica suele considerarse más difícil de realizar que la fusión en tándem, debido a la dificultad para encontrar un sitio de ligadura apropiado en el gen de interés. ^[5]

Conjugación postraduccional

Esta técnica fusiona dominios de proteínas después de la traducción ribosómica de las proteínas de interés, en contraste con la fusión genética antes de la traducción utilizada en otras tecnologías recombinantes. ^[5]

Enlazadores de proteínas

Una proteína utilizada como enlazador en el diseño de proteínas de fusión.

Los enlazadores de proteínas ayudan al diseño de la proteína de fusión al proporcionar un espaciado adecuado entre dominios, lo que respalda el plegamiento correcto de la proteína en el caso de que las interacciones N o C terminales sean cruciales para el plegado. Comúnmente, los enlazadores de proteínas permiten interacciones de dominio importantes, refuerzan la estabilidad y reducen el impedimento estérico, lo que los hace preferidos para su uso en el diseño de proteínas de fusión incluso cuando los extremos N y C pueden fusionarse. Tres tipos principales de enlazadores son flexibles, rígidos y escindibles in vivo. ^{[5] [6]}

• Los enlazadores flexibles pueden consistir en muchos pequeños residuos de glicina , lo que les da la capacidad de curvarse en una forma dinámica y adaptable. ^[6]
• Los enlazadores rígidos pueden estar formados por residuos de prolina cíclicos grandes, que pueden ser útiles cuando se debe mantener un espaciado muy específico entre dominios. ^[6]
• Los enlazadores escindibles in vivo son únicos porque están diseñados para permitir la liberación de uno o más dominios fusionados en determinadas condiciones de reacción, como un gradiente de pH específico , o cuando entran en contacto con otra biomolécula en la célula. ^[6]

Ocurrencia natural

Los genes de fusión que ocurren naturalmente se crean más comúnmente cuando una translocación cromosómica reemplaza los exones terminales de un gen con exones intactos de un segundo gen. Esto crea un único gen que se puede transcribir , empalmar y traducir para producir una proteína de fusión funcional. Muchos oncogenes importantes que promueven el cáncer son genes de fusión producidos de esta manera.

Ejemplos incluyen:

• Proteína de fusión gag-onc
• Proteína de fusión bcr-abl
• Proteína de fusión Tpr-met

Los anticuerpos son proteínas de fusión producidas por V (D) J recombinación .

También hay ejemplos raros de polipéptidos de origen natural que parecen ser una fusión de dos módulos claramente definidos, en los que cada módulo muestra su actividad o función característica, independientemente del otro. Dos ejemplos principales son: la quimera doble PP2C en Plasmodium falciparum (el parásito de la malaria), en la que cada módulo PP2C exhibe actividad enzimática de la proteína fosfatasa 2C, ^[7] y las inmunofilinas de doble familia que se encuentran en varios organismos unicelulares (como protozoos parásitos y flavobacterias) y contienen módulos de chaperona de ciclofilina y FKBP completos. ^{[8] [9]} El origen evolutivo de tal quimera sigue sin estar claro.

Ver también

• Ingeniería genética
• Ingeniería de proteínas

Referencias

1. Schmidt A, Wiesner B, Schülein R, Teichmann A (2014). El uso de Kaede y Kikume verde-rojo fusiones de imágenes de células vivas de G receptores acoplados a proteínas . Métodos en Biología Molecular. 1174 . Nueva York, NY: Humana Press. págs. 139-156. doi : 10.1007 / 978-1-4939-0944-5_9 . ISBN 9781493909438. PMID  24947379 .
2. Baldo BA (mayo de 2015). "Proteínas de fusión quiméricas utilizadas para terapia: indicaciones, mecanismos y seguridad". Seguridad de los medicamentos . 38 (5): 455–79. doi : 10.1007 / s40264-015-0285-9 . PMID 25832756 . 
3. Jugder BE, Welch J, Braidy N, Marquis CP (26 de julio de 2016). "Construcción y uso de una fusión del promotor de hidrogenasa soluble (PSH) de Cupriavidus necator H16 a gfp (proteína verde fluorescente)" . PeerJ . 4 : e2269. doi : 10.7717 / peerj.2269 . PMC 4974937 . PMID 27547572 .  
4. Yang H, Liu L, Xu F (octubre de 2016). "Las promesas y desafíos de las construcciones de fusión en bioquímica de proteínas y enzimología". Microbiología y Biotecnología Aplicadas . 100 (19): 8273–81. doi : 10.1007 / s00253-016-7795-y . PMID 27541749 . 
5. Yu K, Liu C, Kim BG, Lee DY (1 de enero de 2015). "Diseño y aplicaciones de proteínas de fusión sintéticas". Avances en biotecnología . 33 (1): 155-164. doi : 10.1016 / j.biotechadv.2014.11.005 . PMID 25450191 . 
6. Chen X, Zaro JL, Shen WC (octubre de 2013). "Enlazadores de proteínas de fusión: propiedad, diseño y funcionalidad" . Revisiones avanzadas de entrega de medicamentos . 65 (10): 1357–69. doi : 10.1016 / j.addr.2012.09.039 . PMC 3726540 . PMID 23026637 .  
7. Mamoun CB, Sullivan DJ, Banerjee R, Goldberg DE (mayo de 1998). "Identificación y caracterización de una proteína fosfatasa 2C de serina / treonina doble inusual en el parásito de la malaria Plasmodium falciparum" . La Revista de Química Biológica . 273 (18): 11241–7. doi : 10.1074 / jbc.273.18.11241 . PMID 9556615 . 
8. Adams B, Musiyenko A, Kumar R, Barik S (julio de 2005). "Una nueva clase de inmunofilinas de doble familia" . La Revista de Química Biológica . 280 (26): 24308–14. doi : 10.1074 / jbc.M500990200 . PMC 2270415 . PMID 15845546 .  
9. Barik S (noviembre de 2017). "Sobre el papel, la ecología, la filogenia y la estructura de las inmunofilinas de doble familia" . Estrés celular y acompañantes . 22 (6): 833–845. doi : 10.1007 / s12192-017-0813-x . PMC 5655371 . PMID 28567569 .  

Enlaces externos

Recursos de la biblioteca sobre la proteína Fusion

Recursos en su biblioteca Recursos en otras bibliotecas

• Mutant + Chimeric + Proteins en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
• ChiPPI : Interacción servidor-proteína-proteína de proteínas quiméricas.