La precipitación con sulfato de amonio es uno de los métodos más comúnmente utilizados para la purificación y el fraccionamiento de proteínas a gran escala ya escala de laboratorio que se puede utilizar para separar proteínas alterando su solubilidad en presencia de una alta concentración de sal.
Propiedades
El sulfato de amonio es una sal inorgánica de alta solubilidad que se disocia en amonio (NH 4 + ) y sulfato (SO 4 2− ) en soluciones acuosas. [1] El sulfato de amonio es especialmente útil como precipitante porque es altamente soluble, estabiliza la estructura de la proteína, tiene una densidad relativamente baja, está fácilmente disponible y es relativamente económico.
Mecanismo
El sulfato de amonio, así como otras sales neutras, estabilizarán las proteínas mediante solvatación preferencial . Las proteínas generalmente se almacenan en sulfato de amonio porque inhibe el crecimiento bacteriano. Con la adición de sulfato de amonio, las proteínas desarrolladas por desnaturalizantes pueden empujarse a sus conformaciones nativas. Esto se puede ver con el plegamiento de proteínas recombinantes. [2]
La solubilidad de las proteínas varía según la fuerza iónica de la solución y, por tanto, según la concentración de sal. A bajas concentraciones de iones (<0,5 M), la solubilidad de las proteínas aumenta con el aumento de la concentración de sal, un efecto denominado " salazón ". A medida que aumenta más la concentración de sal, la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. Con una fuerza iónica suficientemente alta, la proteína precipitará fuera de la solución, un efecto denominado " salado ". [3] Cuando los iones de amonio (NH 4 + ) y sulfato (SO 4 2− ) están dentro de la solución acuosa, son atraídos por las cargas opuestas evidentes en el compuesto que se está purificando. Esta atracción de cargas opuestas evita que las moléculas de agua interactúen con el compuesto que se está purificando, lo que lleva a la precipitación o "salinización". [2]
Las proteínas difieren notablemente en sus solubilidades a alta fuerza iónica, por lo tanto, la "salificación" es un procedimiento muy útil para ayudar en la purificación de la proteína deseada. El sulfato de amonio se usa comúnmente para la precipitación debido a su alta solubilidad, además, forma dos iones altos en la serie Hofmeister . Debido a que estos dos iones están al final de la serie de Hofmeister, el sulfato de amonio también puede estabilizar la estructura de una proteína. [3] El comportamiento de solubilidad del sulfato de amonio para una proteína generalmente se expresa como una función del porcentaje de saturación. Se puede determinar una curva de solubilidad trazando el logaritmo de la solubilidad determinada experimentalmente, expresada como mg / ml, frente al porcentaje de saturación de sulfato de amonio. [4]
Con el mecanismo de salazón, se omite la sal de la capa de agua, que está estrechamente asociada con la superficie de la proteína, conocida como capa de hidratación. La capa de hidratación juega un papel vital en el mantenimiento de la solubilidad y la conformación natural adecuada. Hay tres interacciones principales entre proteína y agua: hidratación iónica entre cadenas laterales cargadas, enlaces de hidrógeno entre grupos polares y agua e hidratación hidrófoba. Una vez que se agrega sal a la mezcla, hay un aumento en la tensión superficial del agua, aumentando así las interacciones hidrofóbicas entre el agua y la proteína de interés. La proteína de interés luego reduce su área de superficie, lo que disminuye su contacto con el solvente. Esto se demuestra por el plegamiento y la autoasociación, que finalmente conduce a la precipitación. El plegamiento y la autoasociación de la proteína expulsa el agua libre, lo que conduce a un aumento de la entropía y hace que este proceso sea energéticamente favorable. [2]
Procedimiento
Típicamente, la concentración de sulfato de amonio se incrementa paso a paso y la proteína precipitada se recupera en cada etapa. Esto generalmente se hace agregando sulfato de amonio sólido; sin embargo, puede resultar difícil calcular la cantidad de sulfato de amonio que debe agregarse a una solución para lograr la concentración deseada porque la adición de sulfato de amonio aumenta significativamente el volumen de la solución. La cantidad de sulfato de amonio que debe agregarse a la solución se puede determinar a partir de nomogramas publicados o utilizando una calculadora en línea. [5] La adición directa de sulfato de amonio sólido cambia el pH de la solución, lo que puede provocar una pérdida de actividad enzimática. [6] En esos casos, la adición de sulfato de amonio saturado en un tampón adecuado se utiliza como alternativa a la adición de sulfato de amonio sólido. En cualquier enfoque, el precipitado de proteína resultante puede disolverse individualmente en un tampón estándar y ensayarse para determinar el contenido total de proteína.
La concentración de sulfato de amonio agregada debe aumentarse a un valor que precipite la mayor parte de la proteína de interés, dejando la cantidad máxima de contaminantes proteicos todavía en la solución. La proteína de interés precipitada se puede recuperar posteriormente mediante centrifugación y disolver en tampón estándar para preparar la muestra para la siguiente etapa de purificación.
En la siguiente etapa de purificación, toda esta sal agregada debe eliminarse de la proteína. Una forma de hacerlo es mediante diálisis, pero la diálisis diluye aún más la proteína concentrada. La mejor forma de eliminar el sulfato de amonio de la proteína es mezclar la proteína precipitada en un tampón que contiene una mezcla de SDS, Tris-HCl y fenol y centrifugar la mezcla. El precipitado que sale de esta centrifugación contendrá proteína concentrada sin sal. [7]
Aplicaciones
La precipitación con sulfato de amonio es una técnica útil como paso inicial en la purificación de proteínas porque permite la precipitación masiva y rápida de proteínas celulares. [4] También se emplea a menudo durante las últimas etapas de purificación para concentrar la proteína de la solución diluida siguiendo procedimientos como la filtración en gel . El inconveniente de este método es que a menudo pueden precipitar diferentes sustancias junto con la proteína, y se deben realizar otras técnicas de purificación, como la cromatografía iónica o la cromatografía de exclusión por tamaño . [3]
Referencias
- ^ "Sulfato de amonio" . PubChem . Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU . Consultado el 5 de mayo de 2017 .
- ^ a b c Wingfield P (mayo de 2001). "Precipitación de proteínas mediante sulfato de amonio" . Protocolos actuales en la ciencia de las proteínas . Apéndice 3 (1): A.3F.1 – A.3F.8. doi : 10.1002 / 0471140864.psa03fs13 . ISBN 0471140864. PMC 4817497 . PMID 18429073 .
- ^ a b c Duong-Ly KC, Gabelli SB (2014). "Salado de proteínas mediante precipitación con sulfato de amonio". Métodos en enzimología . 541 : 85–94. doi : 10.1016 / B978-0-12-420119-4.00007-0 . ISBN 9780124201194. PMID 24674064 .
- ^ a b Burgess RR (2009). "Técnicas de precipitación de proteínas". Métodos en enzimología . 463 : 331–42. doi : 10.1016 / S0076-6879 (09) 63020-2 . PMID 19892180 .
- ^ "Calculadora de sulfato de amonio" . Encor Biotecnología Inc . Consultado el 19 de abril de 2013 .
- ^ "[7a] Ácido graso sintasa de hígado de pollo" . ScienceDirect . 1975-01-01. págs. 59–65. doi : 10.1016 / 0076-6879 (75) 35138-0 . ISSN 0076-6879 . Consultado el 31 de octubre de 2020 .
- ^ Wang W, Liu QJ, Cui H (julio de 2007). "Desalación rápida y recuperación de proteínas con fenol después del fraccionamiento con sulfato de amonio". Electroforesis . 28 (14): 2358–60. doi : 10.1002 / elps.200600743 . PMID 17577882 . S2CID 33402573 .