La cromatografía de intercambio aniónico es un proceso que separa sustancias en función de sus cargas utilizando una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados positivamente, como los grupos dietil-aminoetilo (DEAE). [2] En solución, la resina se recubre con contraiones cargados positivamente ( cationes ). Las resinas de intercambio aniónico se unirán a moléculas cargadas negativamente, desplazando el contraión. La cromatografía de intercambio aniónico se usa comúnmente para purificar proteínas , aminoácidos , azúcares / carbohidratos y otras sustancias ácidas [3] con una carga negativa a un pH más alto.niveles. La firmeza de la unión entre la sustancia y la resina se basa en la fuerza de la carga negativa de la sustancia.
Acrónimo | HPAE [1] |
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Clasificación | Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía en columna |
Otras tecnicas | |
Relacionados | Cromatografía Cromatografía líquida de alta resolución Cromatografía acuosa en fase normal Cromatografía de exclusión por tamaño Cromatografía líquida micelar |
Técnica general de purificación de proteínas.
Se vierte una suspensión de resina, como DEAE-Sephadex, en la columna. La matriz que se utiliza es insoluble con grupos cargados que están unidos covalentemente. Estos grupos cargados se denominan intercambiadores como intercambiadores de cationes y aniones. Una vez que se asienta, la columna se preequilibra en tampón antes de aplicar la mezcla de proteínas. DEAE-Sephadex es una suspensión cargada positivamente que tendrá interacciones electrostáticas con los átomos cargados negativamente, haciéndolos eluir más tarde que las moléculas cargadas positivamente en la muestra interesada. Esta es una técnica de separación ampliamente utilizada para descubrir proteínas o enzimas específicas en el cuerpo. [2] Las proteínas no unidas se recogen en el flujo continuo y / o en lavados de tampón posteriores. Las proteínas que se unen a la resina cargada positivamente se retienen y pueden eluirse de dos formas. Primero, se aumenta gradualmente la concentración de sal en el tampón de elución. Los iones negativos en la solución salina (por ejemplo, Cl - ) compiten con la proteína para unirse a la resina. En segundo lugar, el pH de la solución se puede reducir gradualmente, lo que da como resultado una carga más positiva en la proteína, liberándola de la resina. Ambas técnicas pueden desplazar la proteína cargada negativamente que luego se eluye en fracciones de tubos de ensayo con el tampón. [4] [5] [6]
La separación de proteínas dependerá de las diferencias en la carga total. La composición de los grupos de cadena lateral ionizables determinará la carga total de la proteína a un pH particular . En el punto isoeléctrico (pI) , la carga total de la proteína es 0 y no se unirá a la matriz. Si el pH está por encima del pI, la proteína tendrá una carga negativa y se unirá a la matriz en una columna de intercambio aniónico. La estabilidad de la proteína en valores por encima o por debajo del pI determinará si se debe utilizar una columna de intercambio aniónico o una columna de intercambio catiónico. Si es estable a valores de pH por debajo del pI, se utilizará la columna de intercambio catiónico. Si es estable a valores de pH superiores al pI, entonces se puede utilizar la columna de intercambio aniónico. [7]
Referencias
- ^ Lee, YC (1990). "Cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento para análisis de carbohidratos". Bioquímica analítica . 189 (2): 151–62. doi : 10.1016 / 0003-2697 (90) 90099-u . PMID 2281856 .
- ^ a b Fotsis, T., H. Adlercreutz; Järvenpää, Paula; Setchell, KDR; Axelson, M .; Sjövall, J. (1981). "Separación de grupos de conjugados de esteroides por cromatografía de intercambio aniónico DEAE-Sephadex". Revista de bioquímica de esteroides . 14 (5): 457–63. doi : 10.1016 / 0022-4731 (81) 90357-5 . PMID 7300338 .
- ^ Rocklin, Roy D .; Pohl, Christopher A. (1983). "Determinación de carbohidratos por cromatografía de intercambio aniónico con detección amperométrica pulsada". Revista de cromatografía líquida . 6 (9): 1577–590. doi : 10.1080 / 01483918308064876 .
- ^ Duong-Ly, Krisna C .; Gabelli, Sandra B. (2014). Capítulo ocho - Utilización de la cromatografía de intercambio iónico para purificar una proteína de expresión recombinante . Métodos en enzimología. 541 . Prensa académica. págs. 95-103. doi : 10.1016 / b978-0-12-420119-4.00008-2 . ISBN 9780124201194. PMID 24674065 .
- ^ "Intercambio iónico FPLC y cromatoenfoque: principios y métodos". Pharmacia Biotech . Pharmacia Biotech AB. 1985.
- ^ Guía de cromatografía de intercambio iónico . Aparato de Harvard. pag. 2.
- ^ Guía de cromatografía de intercambio iónico . Aparato de Harvard. pag. 3.