La cromatografía en columna en química es un método de cromatografía que se utiliza para aislar un solo compuesto químico de una mezcla. La cromatografía es capaz de separar sustancias basándose en la adsorción diferencial de compuestos al adsorbente; los compuestos se mueven a través de la columna a diferentes velocidades, lo que les permite separarse en fracciones. La técnica es ampliamente aplicable, ya que se pueden usar muchos adsorbentes diferentes (fase normal, fase reversa u otros) con una amplia gama de disolventes. La técnica se puede utilizar en escalas desde microgramos hasta kilogramos. La principal ventaja de la cromatografía en columna es el costo relativamente bajo y la disponibilidad de la fase estacionaria.utilizado en el proceso. Este último evita la contaminación cruzada y la degradación de la fase estacionaria debido al reciclaje. La cromatografía en columna se puede realizar usando la gravedad para mover el solvente, o usando gas comprimido para empujar el solvente a través de la columna.
Un cromatógrafo de capa fina puede mostrar cómo se comportará una mezcla de compuestos cuando se purifique mediante cromatografía en columna. La separación se optimiza primero mediante cromatografía en capa fina antes de realizar la cromatografía en columna.
Preparación de la columna
Una columna se prepara empaquetando un absorbente sólido en un tubo cilíndrico de vidrio o plástico. El tamaño dependerá de la cantidad de compuesto que se aísle. La base del tubo contiene un filtro, ya sea un tapón de algodón o lana de vidrio, o frita de vidrio para mantener la fase sólida en su lugar. Se puede colocar un depósito de disolvente en la parte superior de la columna.
Generalmente se utilizan dos métodos para preparar una columna: el método seco y el método húmedo. Para el método seco, la columna se llena primero con polvo seco de fase estacionaria, seguido de la adición de fase móvil, que se enjuaga a través de la columna hasta que esté completamente húmeda, y desde este punto nunca se deja que se seque. [1] Para el método húmedo, se prepara una suspensión del eluyente con el polvo de la fase estacionaria y luego se vierte cuidadosamente en la columna. La parte superior de la sílice debe ser plana y la parte superior de la sílice puede protegerse con una capa de arena. El eluyente se pasa lentamente a través de la columna para hacer avanzar el material orgánico.
Los componentes individuales son retenidos por la fase estacionaria de manera diferente y se separan entre sí mientras corren a diferentes velocidades a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna eluyen uno a la vez. Durante todo el proceso de cromatografía, el eluyente se recoge en una serie de fracciones . Las fracciones se pueden recolectar automáticamente mediante recolectores de fracciones. La productividad de la cromatografía se puede aumentar ejecutando varias columnas a la vez. En este caso, se utilizan colectores de flujo múltiple. La composición del flujo de eluyente se puede controlar y cada fracción se analiza en busca de compuestos disueltos, por ejemplo, mediante cromatografía analítica, espectros de absorción UV o fluorescencia . Los compuestos coloreados (o compuestos fluorescentes con la ayuda de una lámpara ultravioleta) se pueden ver a través de la pared de vidrio como bandas móviles.
Fase estacionaria
La fase estacionaria o adsorbente en la cromatografía en columna es un sólido. La fase estacionaria más común para la cromatografía en columna es el gel de sílice , y la siguiente más común es la alúmina . El polvo de celulosa se ha utilizado a menudo en el pasado. Se encuentra disponible una amplia gama de fases estacionarias para realizar cromatografía de intercambio iónico , cromatografía de fase inversa (RP), cromatografía de afinidad o adsorción en lecho expandido (EBA). Las fases estacionarias suelen ser polvos o geles finamente molidos y / o son microporosas para aumentar la superficie, aunque en EBA se utiliza un lecho fluidizado. Existe una relación importante entre el peso de la fase estacionaria y el peso seco de la mezcla de analitos que se puede aplicar a la columna. Para la cromatografía en columna de sílice, esta relación se encuentra entre 20: 1 y 100: 1, dependiendo de qué tan cerca se estén eluyendo los componentes del analito. [2]
Fase móvil (eluyente)
La fase móvil o eluyente es un disolvente o una mezcla de disolventes que se utilizan para mover los compuestos a través de la columna. Se elige de modo que el valor del factor de retención del compuesto de interés esté aproximadamente entre 0,2 y 0,3 para minimizar el tiempo y la cantidad de eluyente para realizar la cromatografía. El eluyente también se ha elegido de modo que los diferentes compuestos puedan separarse de forma eficaz. El eluyente se optimiza en pruebas preliminares a pequeña escala, a menudo utilizando cromatografía en capa fina (TLC) con la misma fase estacionaria.
Existe un caudal óptimo para cada separación en particular. Una velocidad de flujo más rápida del eluyente minimiza el tiempo requerido para hacer funcionar una columna y, por lo tanto, minimiza la difusión, lo que resulta en una mejor separación. Sin embargo, el caudal máximo está limitado porque se requiere un tiempo finito para que el analito se equilibre entre la fase estacionaria y la fase móvil, ver la ecuación de Van Deemter . Una simple columna de laboratorio funciona con flujo por gravedad . El caudal de dicha columna puede aumentarse extendiendo la columna llena de eluyente nuevo por encima de la parte superior de la fase estacionaria o disminuirse mediante los controles del grifo. Se pueden lograr velocidades de flujo más rápidas usando una bomba o usando gas comprimido (por ejemplo, aire, nitrógeno o argón ) para empujar el solvente a través de la columna (cromatografía en columna ultrarrápida). [3] [4]
El tamaño de partícula de la fase estacionaria es generalmente más fino en la cromatografía en columna ultrarrápida que en la cromatografía en columna por gravedad. Por ejemplo, uno de los grados de gel de sílice más utilizados en la primera técnica es malla 230 - 400 (40 - 63 µm), mientras que la última técnica requiere típicamente gel de sílice de malla 70 - 230 (63 - 200 µm). [5]
Se ha desarrollado una hoja de cálculo que ayuda al desarrollo exitoso de columnas flash. La hoja de cálculo estima el volumen de retención y el volumen de banda de los analitos, los números de fracción que se espera que contengan cada analito y la resolución entre picos adyacentes. Esta información permite a los usuarios seleccionar los parámetros óptimos para las separaciones a escala preparativa antes de intentar la columna flash. [6]
Sistemas automatizados
La cromatografía en columna es una etapa que requiere mucho tiempo en cualquier laboratorio y puede convertirse rápidamente en el cuello de botella de cualquier laboratorio de procesos. Muchos fabricantes como Biotage, Buchi, Interchim y Teledyne Isco han desarrollado sistemas de cromatografía ultrarrápida automatizados (normalmente denominados LPLC, cromatografía líquida de baja presión, alrededor de 350–525 kPa o 50,8–76,1 psi) que minimizan la participación humana en el proceso de purificación. Los sistemas automatizados incluirán componentes que normalmente se encuentran en sistemas de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) más costosos , como una bomba de gradiente, puertos de inyección de muestras, un detector UV y un colector de fracciones para recolectar el eluyente. Por lo general, estos sistemas automatizados pueden separar muestras desde unos pocos miligramos hasta una escala industrial de muchos kilogramos y ofrecen una solución mucho más barata y rápida para realizar múltiples inyecciones en sistemas de prep-HPLC.
La resolución (o la capacidad de separar una mezcla) en un sistema LPLC siempre será menor en comparación con HPLC, ya que el material de empaque en una columna HPLC puede ser mucho más pequeño, típicamente solo 5 micrómetros, aumentando así el área de superficie de la fase estacionaria, aumentando las interacciones de la superficie. y dando mejor separación. Sin embargo, el uso de este pequeño medio de relleno provoca la alta contrapresión y es por eso que se denomina cromatografía líquida de alta presión. Las columnas LPLC suelen estar empaquetadas con sílice de alrededor de 50 micrómetros, lo que reduce la contrapresión y la resolución, pero también elimina la necesidad de costosas bombas de alta presión. Los fabricantes ahora están comenzando a moverse hacia sistemas de cromatografía ultrarrápida de alta presión y los han denominado sistemas de cromatografía líquida de presión media (MPLC) que operan por encima de 1 MPa (150 psi).
Cálculo de la resolución del cromatograma de columna
Normalmente, la cromatografía en columna se configura con bombas peristálticas, tampones de flujo y la muestra de solución a través de la parte superior de la columna. Las soluciones y los tampones pasan a través de la columna donde un recolector de fracciones al final de la configuración de la columna recolecta las muestras eluidas. Antes de la recolección de la fracción, las muestras que se eluyen de la columna pasan a través de un detector como un espectrofotómetro o espectrómetro de masas para poder determinar la concentración de las muestras separadas en la mezcla de la solución de muestra.
Por ejemplo, si separara dos proteínas diferentes con diferentes capacidades de unión a la columna de una muestra de solución, un buen tipo de detector sería un espectrofotómetro con una longitud de onda de 280 nm. Cuanto mayor sea la concentración de proteína que pasa a través de la solución eluida a través de la columna, mayor será la absorbancia de esa longitud de onda.
Debido a que la cromatografía en columna tiene un flujo constante de solución eluida que pasa a través del detector a concentraciones variables, el detector debe trazar la concentración de la muestra eluida a lo largo del tiempo. Esta gráfica de concentración de la muestra en función del tiempo se denomina cromatograma.
El objetivo final de la cromatografía es separar diferentes componentes de una mezcla de solución. La resolución expresa el grado de separación entre los componentes de la mezcla. Cuanto mayor sea la resolución del cromatograma, mejor será el grado de separación de las muestras que da la columna. Estos datos son una buena forma de determinar las propiedades de separación de la columna de esa muestra en particular. La resolución se puede calcular a partir del cromatograma.
Las curvas separadas en el diagrama representan diferentes perfiles de concentración de elución de la muestra a lo largo del tiempo en función de su afinidad por la resina de la columna. Para calcular la resolución, se requieren el tiempo de retención y el ancho de la curva.
El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de la detección de la señal por el detector hasta la altura máxima del perfil de concentración de elución de cada muestra diferente.
El ancho de la curva es el ancho de la curva del perfil de concentración de las diferentes muestras en el cromatograma en unidades de tiempo.
Un método simplificado para calcular la resolución del cromatograma es utilizar el modelo de placa. [7] El modelo de placa asume que la columna se puede dividir en un cierto número de secciones o placas y el balance de masa se puede calcular para cada placa individual. Este enfoque se aproxima a una curva de cromatograma típica como una curva de distribución gaussiana . Al hacer esto, el ancho de la curva se estima como 4 veces la desviación estándar de la curva, 4σ. El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de la detección de la señal hasta el momento de la altura del pico de la curva gaussiana.
A partir de las variables de la figura anterior, la resolución, el número de placa y la altura de la placa del modelo de placa de columna se pueden calcular utilizando las ecuaciones:
Resolución (R s )
R s = 2 (t RB - t RA ) / (w B + w A )
Donde:
t RB = tiempo de retención del soluto B
t RA = tiempo de retención del soluto A
w B = ancho de la curva gaussiana del soluto B
w A = ancho de la curva gaussiana del soluto A
Número de placa (N):
N = (t R ) 2 / (w / 4) 2
Altura de la placa (H):
H = L / N
Donde L es la longitud de la columna. [7]
Equilibrio de adsorción de columna
Para una columna de adsorción, la resina de la columna (la fase estacionaria) está compuesta de microperlas. Incluso partículas más pequeñas, como proteínas, carbohidratos, iones metálicos u otros compuestos químicos, se conjugan en las microperlas. Se puede suponer que cada partícula de unión que se une a la microperla se une en una proporción de 1: 1 con la muestra de soluto enviada a través de la columna que debe purificarse o separarse.
La unión entre la molécula diana que se va a separar y la molécula de unión en las cuentas de la columna se puede modelar usando una reacción de equilibrio simple K eq = [CS] / ([C] [S]) donde K eq es la constante de equilibrio , [C] y [S] son las concentraciones de la molécula diana y la molécula de unión en la columna de resina, respectivamente. [CS] es la concentración del complejo de la molécula diana unida a la resina de la columna. [7]
Usando esto como base, se pueden usar tres isotermas diferentes para describir la dinámica de unión de una cromatografía en columna: lineal, Langmuir y Freundlich.
La isoterma lineal se produce cuando la concentración de soluto necesaria para purificar es muy pequeña en relación con la molécula de unión. Por tanto, el equilibrio se puede definir como:
[CS] = K eq [C].
Para usos a escala industrial, las moléculas de unión totales en las perlas de resina de la columna deben tenerse en cuenta porque deben tenerse en cuenta los sitios desocupados. La isoterma de Langmuir y la isoterma de Freundlich son útiles para describir este equilibrio. Isoterma de Langmuir:
[CS] = (K eq S tot [C]) / (1 + K eq [C]), donde S tot es el total de moléculas de unión en las perlas.
Isoterma de Freundlich:
[CS] = K eq [C] 1 / n
La isoterma de Freundlich se usa cuando la columna puede unirse a muchas muestras diferentes en la solución que necesita purificarse. Debido a que las muchas muestras diferentes tienen diferentes constantes de unión a las perlas, existen muchos Keq diferentes. Por tanto, la isoterma de Langmuir no es un buen modelo de unión en este caso. [7]
Ver también
- Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para cromatografía en columna a alta presión.
- Cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) para la separación de proteínas mediante cromatografía en columna.
Referencias
- ^ Shusterman, AJ; McDougal, PG; Glasfeld, A (1997). "Cromatografía ultrarrápida en columna seca". J Chem Educ . 74 (10): 1222. Bibcode : 1997JChEd..74.1222S . doi : 10.1021 / ed074p1222 . ISSN 0021-9584 .
- ^ "Cómo configurar una columna de sílice de cromatografía flash y realmente tener éxito en la separación" . reachdevices.com . REACH Devices, LLC . Consultado el 3 de enero de 2019 .
- ^ Aún así, WC; Kahn, M; Mitra, A (1978). "Técnica cromatográfica rápida para separaciones preparativas con resolución moderada". J Org Chem . ACS . 43 (14): 2923-2925. doi : 10.1021 / jo00408a041 .
- ^ Harwood LM, Moody CJ (13 de junio de 1989). Química orgánica experimental: principios y práctica (edición ilustrada). Londres: Blackwell. págs. 180-185 . ISBN 978-0-632-02017-1. OCLC 1079261960 .
- ^ "Gel de sílice Material Harvest para cromatografía en columna de fase normal" . Cosecha de material. 2008 . Consultado el 3 de enero de 2019 .
- ^ Justo, JD; Kormos, CM (2008). "Cromatogramas de columna flash estimados a partir de datos de cromatografía en capa fina". J Chromatogr A . 1211 (1–2): 49–54. doi : 10.1016 / j.chroma.2008.09.085 . ISSN 0021-9673 . PMID 18849041 .
- ^ a b c d Harrison RG, Todd PW, Rudge SR, Petrides DP (2003). Ciencia e ingeniería de bioseparaciones (2ª ed.). Nueva York, NY: Oxford University Press . ISBN 9780190213732. OCLC 899240244 .
enlaces externos
- Guía de cromatografía en columna flash (pdf)
- Cromatografía de flujo radial