La fragmentación del ADN apoptótico es una característica clave de la apoptosis , un tipo de muerte celular programada . La apoptosis se caracteriza por la activación de endonucleasas endógenas , particularmente la ADNasa activada por caspasa-3 (CAD), [1] con la posterior escisión del ADN nuclear en fragmentos internucleosomales de aproximadamente 180 pares de bases (pb) y múltiplos de los mismos (360, 540, etc. ). La fragmentación apoptótica del ADN se está utilizando como marcador de apoptosis y para la identificación de células apoptóticas, ya sea mediante el ensayo de escalera de ADN , [2] el ensayo TUNEL , [3] [4]o mediante la detección de células con contenido fraccional de ADN (" células sub G 1 ") en histogramas de frecuencia de contenido de ADN, por ejemplo, como en el ensayo Nicoletti . [5] [6]
Mecanismo
La enzima responsable de la fragmentación de ADN apoptótico es la C aspase- A ctivated D Nase (CAD) . CAD es normalmente inhibida por otra proteína, la I nhibitor de C aspase A ctivated D Nase (ICAD) . Durante la apoptosis, el efector apoptótico caspasa, caspasa-3 , escinde ICAD y, por lo tanto, hace que la CAD se active. [7]
CAD escinde el ADN en los sitios de enlace internucleosómico entre los nucleosomas , estructuras que contienen proteínas que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~ 180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está envuelto firmemente alrededor de las histonas , las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios de enlace son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por lo tanto, accesibles a CAD.
La degradación del ADN nuclear en unidades nucleosómicas es una de las características distintivas de la muerte celular apoptótica. Ocurre en respuesta a varios estímulos apoptóticos en una amplia variedad de tipos de células. La caracterización molecular de este proceso identificó una ADNasa específica (CAD, ADNasa activada por caspasa) que escinde el ADN cromosómico de una manera dependiente de caspasa. CAD se sintetiza con la ayuda de ICAD (inhibidor de CAD), que funciona como un acompañante específico para CAD y se encuentra complejado con ICAD en células en proliferación. Cuando se induce a las células a sufrir apoptosis, la caspasa 3 escinde ICAD para disociar el complejo CAD: ICAD, lo que permite que CAD escinda el ADN cromosómico. Por tanto, las células que carecen de ICAD o que expresan ICAD mutante resistente a caspasa no muestran fragmentación del ADN durante la apoptosis, aunque sí presentan algunas otras características de la apoptosis y mueren.
Aunque se ha realizado mucho trabajo en el análisis de eventos apoptóticos, hay poca información disponible para vincular el momento de las características morfológicas en la superficie celular y en el núcleo con la degradación bioquímica del ADN en las mismas células. La apoptosis puede iniciarse por una gran cantidad de mecanismos diferentes en diferentes tipos de células, y la cinética de estos eventos varía ampliamente, desde solo unos pocos minutos hasta varios días, según el sistema celular. La presencia o ausencia de eventos apoptóticos particulares, incluida la fragmentación del ADN, depende de la "ventana de tiempo" en la que se investiga el proceso cinético de la apoptosis. A menudo, esto puede complicar la identificación de células apoptóticas si las poblaciones de células se analizan sólo en un único momento, por ejemplo, después de la inducción de la apoptosis.
Antecedentes históricos
El descubrimiento de la fragmentación internucleosómica del ADN genómico en fragmentos oligonucleosomales de repetición regular generados por endonucleasa dependiente de Ca / Mg se acepta como uno de los marcadores bioquímicos de apoptosis mejor caracterizados (muerte celular programada).
En 1970, Williamson describió que el ADN citoplásmico aislado de células de hígado de ratón después del cultivo se caracterizaba por fragmentos de ADN con un peso molecular que constaba de múltiplos de 135 kDa . Este hallazgo fue consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [8] En 1972, Kerr , Wyllie y Currie acuñó el término apoptosis y distinguió este tipo de muerte celular de la necrosis basándose en características morfológicas. [9] En 1973, Hewish y Burgoyne , durante el estudio de la estructura de la subcromatina, encontró que la cromatina es accesible a la endonucleasa Ca ++ / Mg ++ , lo que resulta en la formación de un producto de digestión con una serie regular de peso molecular similar al descrito previamente por Williamson (1970 ). [10] En 1974, Williams , Pequeño y Shipley , utilizando células expuestas a tipos de traumatismos muy diferentes, descubrió que durante la muerte celular, el ADN degradado en "todos los casos tenía un valor modal de entre 10 (x6) y 10 (x7) Dalton y se requiere metabolismo celular para producir la degradación del ADN ". Sin embargo, esta observación no indicaba "si el ataque de la incisión en la molécula de ADN fue aleatorio o más bien en un sitio en particular, que tiene un significado estructural o funcional". [11] En 1976, Scalka , Matyasova y Cejkova describió la fragmentación internucleosómica del ADN de cromatina linfoide irradiado in vivo . [12]
Pasaron seis años desde 1972 hasta 1978/1980 hasta el descubrimiento y evaluación de la fragmentación internucleosomal del ADN durante la muerte celular apoptótica como un sello distintivo de la apoptosis. Desde 1972 ( Kerr , Wyllie y Currie [9] ), se acepta que la muerte de linfocitos inducida por glucocorticoides es una forma de apoptosis. En 1978, Zakharyan y Pogosyan presentó un artículo que revelaba que la degradación del ADN inducida por glucocorticoides en el tejido linfoide, el timo y el bazo de rata se producía en un patrón específico que producía fragmentos de ADN que eran electroforéticamente similares a los observados después del tratamiento de la cromatina con nucleasa micrococcal, lo que indicaba un patrón de escisión internucleosomal de La degradación del ADN ocurrió durante la apoptosis. [13] [14] Por lo tanto, se descubrió el primer vínculo entre la muerte celular programada / apoptosis y la fragmentación internucleosomal del ADN de la cromatina y pronto se convirtió en una característica específica de la apoptosis.
En 1980, Wyllie informó pruebas adicionales de un patrón de escisión del ADN internucleosómico como una característica específica de los timocitos tratados con glucocorticoides que experimentan apoptosis. [2] El patrón de escisión del ADN internucleosómico se observó como una característica específica de la apoptosis en 1978/1980 y se ha convertido en un sello distintivo reconocido de la muerte celular programada desde entonces. En 1992 Gorczyca et al. [3] y Gavrieli et al. [4] describió de forma independiente el ensayo de fragmentación de ADN basado en el uso de la desoxinucleotidil transferasa terminal ( TUNEL ), que se convierte en uno de los métodos estándar para detectar e identificar células apoptóticas.
Ensayos de detección
La citometría de flujo se utiliza con mayor frecuencia para detectar la fragmentación apoptótica del ADN. El análisis del contenido de ADN mediante citometría de flujo puede identificar células apoptóticas con ADN fragmentado como las células con contenido de ADN fraccionado, a menudo llamadas células sub-G 1 . El ensayo de citometría de flujo que utiliza el fluorocromo acridina naranja muestra que la fragmentación del ADN dentro de las células individuales es discontinua, probablemente reflejando diferentes niveles de restricción en la accesibilidad del ADN a la ADNasa, por los niveles supranucleosomales y nucleosómicos de la estructura de la cromatina. [15] La presencia de " células sub-G 1 " apoptóticas también puede detectarse en células prefijadas en etanol, pero no después de la fijación en los fijadores de reticulación como el formaldehído . Es posible que las células apoptóticas S tardías y G 2 no se detecten con este enfoque porque su contenido de ADN fraccional puede solaparse con el de las células G 1 no apoptóticas . [16] El tratamiento de las células con detergente, antes o simultáneamente con el fluorocromo de ADN, también revela la fragmentación del ADN en virtud de la presencia de células sub-G 1 o fragmentos de células, según lo definido por Nicoletti et al. [5]
La fragmentación apoptótica del ADN también se puede detectar mediante el ensayo TUNEL . El ensayo TUNEL basado en fluorocromos aplicable a la citometría de flujo , correlaciona la detección de roturas de la cadena de ADN con el contenido de ADN celular y, por lo tanto, con la posición de la fase del ciclo celular . El ensayo TUNEL de marcado con avidina-peroxidasa es aplicable para microscopía de absorción de luz. Muchos kits relacionados con TUNEL están disponibles comercialmente. La fragmentación del ADN apoptótico también se analiza usando electroforesis en gel de agarosa para demostrar un patrón de "escalera" a intervalos de ~ 180 BP . [1] La necrosis , por otro lado, generalmente se caracteriza por una fragmentación aleatoria del ADN que forma un "frotis" en los geles de agarosa.
Ver también
- DNasa activada por caspasa
- Escalera de ADN
Referencias
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