El análisis del ciclo celular mediante la medición del contenido de ADN es un método que emplea con mayor frecuencia la citometría de flujo para distinguir células en diferentes fases del ciclo celular . Antes del análisis, las células suelen permeabilizarse y tratarse con un colorante fluorescente que tiñe el ADN cuantitativamente, como el yoduro de propidio (PI) o el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La intensidad de la fluorescencia de las células teñidas se correlaciona con la cantidad de ADN que contienen. A medida que el contenido de ADN se duplica durante la fase S , el contenido de ADN (y por lo tanto la intensidad de la fluorescencia) de las células en la fase G 0 y G1 fase (antes de S), en la fase S, y en la fase G 2 y la fase M (después de S) identifica la posición de la fase del ciclo celular en las fases principales (G 0 / G 1 versus S versus G 2 / M fase) del ciclo celular. El contenido de ADN celular de las células individuales a menudo se representa como su histograma de frecuencia para proporcionar información sobre la frecuencia relativa (porcentaje) de las células en las principales fases del ciclo celular.
Las anomalías del ciclo celular reveladas en el histograma de frecuencia de contenido de ADN a menudo se observan después de diferentes tipos de daño celular, por ejemplo, el daño del ADN que interrumpe la progresión del ciclo celular en ciertos puntos de control . Tal detención de la progresión del ciclo celular puede conducir a una reparación efectiva del ADN, que puede prevenir la transformación de células normales en cancerosas ( carcinogénesis ), o la muerte celular, a menudo por el modo de apoptosis . Una detención de las células en G 0 o G 1 se ve a menudo como resultado de la falta de nutrientes (factores de crecimiento), por ejemplo, después de la privación de suero . El análisis del ciclo celular fue descrito por primera vez en 1969 en el Laboratorio Científico de Los Alamos por un grupo de la Universidad de California utilizando la técnica de tinción Feulgen . [1] El primer protocolo para el análisis del ciclo celular usando tinción con yoduro de propidio fue presentado en 1975 por Awtar Krishan de la Escuela de Medicina de Harvard y todavía se cita ampliamente en la actualidad. [2]
El análisis multiparamétrico del ciclo celular incluye, además de la medición del contenido de ADN celular, otros componentes / características relacionados con el ciclo celular. La medición simultánea del contenido de ADN y ARN celular, o la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización a pH bajo utilizando el colorante metacromático acridina naranja , revela los compartimentos del ciclo celular G 1Q , G 1A y G 1B y también permite discriminar entre S, G 2 y células mitóticas. [3] Las células en G 1Q están inactivas, temporalmente retiradas del ciclo celular (también identificables como G 0 ), las G 1A están en la fase de crecimiento mientras que G 1B son las células justo antes de entrar en S, con su crecimiento (ARN y contenido de proteína, tamaño) similar al de las células que inician la replicación del ADN. También se reconocen compartimentos similares del ciclo celular mediante análisis multiparámetro que incluye la medición de la expresión de ciclina D1 , ciclina E , ciclina A y ciclina B1 , cada una en relación con el contenido de ADN [4] Medición simultánea del contenido de ADN y de la incorporación del precursor de ADN 5- La bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) por citometría de flujo es un ensayo especialmente útil, que se ha utilizado ampliamente en el análisis del ciclo celular in vitro e in vivo. [5] Sin embargo, la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), el precursor cuya detección ofrece ciertas ventajas sobre BrdU, se ha convertido ahora en la metodología preferida para detectar células de replicación de ADN (fase S). [6]
Procedimiento experimental
A menos que la tinción se realice con Hoechst 33342 , el primer paso en la preparación de células para el análisis del ciclo celular es la permeabilización de las membranas plasmáticas de las células . Esto generalmente se hace incubándolos en una solución tampón que contenga un detergente suave [7] como Triton X-100 o NP-40 , o fijándolos en etanol . La mayoría de los colorantes de ADN fluorescentes (una de las excepciones es Hoechst 33342 ) no son permeables a la membrana plasmática, es decir, no pueden atravesar una membrana celular intacta. Por tanto, la permeabilización es crucial para el éxito del siguiente paso, la tinción de las células.
Antes (o durante el paso de tinción), las células a menudo se tratan con ARNasa A para eliminar los ARN . Esto es importante porque ciertos tintes que tiñen el ADN también teñirán el ARN, creando así artefactos que distorsionarían los resultados. Una excepción es el metacromático fluorocromo acridina naranja , que bajo el protocolo de tinción específico puede teñir diferencialmente tanto el ARN (que genera luminiscencia roja) como el ADN (fluorescencia verde), o en otro protocolo, después de la eliminación del ARN y la desnaturalización parcial del ADN, para teñir diferencialmente ADN bicatenario (fluorescencia verde) versus ADN monocatenario (luminiscencia roja) [3] . Aparte del yoduro de propidio y la naranja de acridina, los tintes cuantificables que se usan con frecuencia incluyen (pero no se limitan a) DRAQ5, 7-Aminoactinomicina D , DAPI y Hoechst 33342 .
Discriminación de doblete
Dado que las células y especialmente las células fijas tienden a pegarse, los agregados de células deben excluirse del análisis mediante un proceso llamado discriminación por doblete . Esto es importante porque un doblete de dos células G 0 / G 1 tiene el mismo contenido total de ADN y, por tanto, la misma intensidad de fluorescencia que una sola célula G 2 / M. [8] [9] A menos que se reconozca como tal, los dobletes G 0 / G 1 contribuirían a la identificación de falsos positivos y al recuento de células G 2 / M.
Métodos relacionados
Ensayo Nicoletti
El ensayo Nicoletti , que lleva el nombre de su inventor, el médico italiano Ildo Nicoletti , es una forma modificada de análisis del ciclo celular. Se utiliza para detectar y cuantificar la apoptosis , una forma de muerte celular programada , mediante el análisis de células con un contenido de ADN inferior a 2n (" células sub-G 0 / G 1 "). Estas células suelen ser el resultado de la fragmentación apoptótica del ADN : durante la apoptosis, el ADN es degradado por endonucleasas celulares . Por lo tanto, los núcleos de las células apoptóticas contienen menos ADN que los núcleos de las células G 0 / G 1 sanas , lo que da como resultado un pico sub-G 0 / G 1 en el histograma de fluorescencia que se puede utilizar para determinar la cantidad relativa de células apoptóticas en una muestra. . Este método fue desarrollado y descrito por primera vez en 1991 por Nicoletti y sus colaboradores en la Facultad de Medicina de la Universidad de Perugia . [10] En 2006 se publicó un protocolo optimizado desarrollado por dos de los autores de la publicación original. [11] Los objetos medidos dentro del pico sub-G 0 / G 1 , con un contenido de ADN inferior al 5% del de G 0 G 1 pico, con toda probabilidad son cuerpos apoptóticos y, por lo tanto, no representan células apoptóticas individuales [12]
Células sanas. Nótese la ausencia de un pico sub-G 0 / G 1 .
Células apoptóticas un día después de la inducción de la apoptosis. Nótese la presencia de un pico sub-G 0 / G 1 .
Células apoptóticas varios días después de la inducción de la apoptosis. Nótese el aumento relativo del pico sub-G 0 / G 1 .
Referencias
- ^ Van Dilla MA, Trujillo TT, Mullaney PF, Coulter JR (14 de marzo de 1969). "Microfluorometría celular: un método para la medición rápida de fluorescencia". Ciencia . 163 (3872): 1213–1214. Código Bibliográfico : 1969Sci ... 163.1213V . doi : 10.1126 / science.163.3872.1213 . PMID 5812751 .
- ^ Krishan A. (julio de 1975). "Análisis citofluorométrico de flujo rápido del ciclo celular de mamíferos mediante tinción con yoduro de propidio" . The Journal of Cell Biology . 66 (1): 188-193. doi : 10.1083 / jcb.66.1.188 . PMC 2109516 . PMID 49354 .
- ^ Darzynkiewicz Z, Traganos F, Melamed MR (1980). "Nuevos compartimentos del ciclo celular identificados por citometría de flujo multiparamétrica". Citometría . 1 (2): 98–108. doi : 10.1002 / cyto.990010203 . PMID 6170495 .
- ^ Darzynkiewicz Z, Gong JP, Juan G, Ardelt B, Traganos F (1996). "Citometría de proteínas ciclina" . Citometría . 25 (1): 1–13. doi : 10.1002 / (SICI) 1097-0320 (19960901) 25: 1 <1 :: AID-CYTO1> 3.0.CO; 2-N . PMID 8875049 .
- ^ Gray JW, Dolbeare F, Pallavicini MG, Beisker W, Waldman F (1986). "Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo". Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med . 49 (2): 237–55. doi : 10.1080 / 09553008514552531 . PMID 3510993 .
- ^ Buck SB, Bradford J, Gee KR, Agnew BJ, Clarke ST, Salic A (2008). "Detección de la progresión del ciclo celular en fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina con química de clic, una alternativa al uso de anticuerpos 5-bromo-2'-desoxiuridina" . BioTechniques . 44 (7): 927–9. doi : 10.2144 / 000112812 . PMID 18533904 .
- ^ Vindeløv LL, Christensen IJ, Nissen NI (marzo de 1983). "Un método detergente-tripsina para la preparación de núcleos para análisis de ADN por citometría de flujo". Citometría . 3 (5): 323–327. doi : 10.1002 / cyto.990030503 . PMID 6188586 .
- ^ Sharpless T, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Melamed MR (1975). "Citofluorimetría de flujo: discriminación entre células individuales y agregados celulares mediante medidas directas de tamaño". Acta Cytol . 19 (6): 577–81. PMID 1108568 .
- ^ Wersto RP, Chrest FJ, Leary JF, Morris C, Stetler-Stevenson MA, Gabrielson E (15 de octubre de 2001). "Discriminación de doblete en el análisis del ciclo celular del ADN" . Citometría . 46 (5): 296-306. doi : 10.1002 / cyto.1171 . PMID 11746105 .
- ^ Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3 de junio de 1991). "Un método rápido y sencillo para medir la apoptosis de timocitos mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo". Revista de métodos inmunológicos . 139 (2): 271–279. doi : 10.1016 / 0022-1759 (91) 90198-O . PMID 1710634 .
- ^ Riccardi C, Nicoletti I (9 de noviembre de 2006). "Análisis de apoptosis por tinción de yoduro de propidio y citometría de flujo". Protocolos de la naturaleza . 1 (3): 1458–1461. doi : 10.1038 / nprot.2006.238 . PMID 17406435 .
- ^ Darzynkiewicz Z, Bedner E, Traganos F (2001). "Dificultades y escollos en el análisis de la apoptosis". Métodos Cell Biol . 63 : 527–559. doi : 10.1016 / s0091-679x (01) 63028-0 . PMID 11060857 .
Otras lecturas
- "Conceptos básicos del ciclo celular" (PDF) . University College de Londres. Archivado desde el original (PDF, 0,1 MB) el 6 de junio de 2011 . Consultado el 20 de mayo de 2010 .
- Rabinovitch, Peter. "Introducción al análisis del ciclo celular" (PDF, 0,5 MB) . Phoenix Flow Systems, Inc . Consultado el 20 de mayo de 2010 .