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Un balón de fútbol que contiene una solución clara de malva
El color característico de una prueba de biuret positiva.

El biuret (IPA: / ˌ b aɪ j ə r ɛ t / , / ab aɪ j ə ˌ r ɛ t / ) [1] de prueba , también conocida como la prueba de Piotrowski , es una prueba química utilizada para detectar la presencia de enlaces peptídicos . En la presencia de péptidos, un cobre (II) de iones formas malva -colored complejos de coordinación en un alcalinasolución. [2] Se han desarrollado varias variantes de la prueba, como la prueba BCA y la prueba de Lowry modificada. [3]

La reacción de biuret se puede utilizar para evaluar la concentración de proteínas porque los enlaces peptídicos se producen con la misma frecuencia por aminoácido en el péptido. La intensidad del color, y por tanto la absorción a 540 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteína, según la ley de Beer-Lambert .

A pesar de su nombre, el reactivo no contiene biuret ((H 2 N-CO-) 2 NH). La prueba se llama así porque también da una reacción positiva a los enlaces de tipo péptido en la molécula de biuret.

En este ensayo, el cobre (II) se une a los nitrógenos presentes en los péptidos de las proteínas. En una reacción secundaria, el cobre (II) se reduce a cobre (I). Los tampones, como Tris y amoniaco, interfieren con este ensayo, por lo que este ensayo es inadecuado para muestras de proteínas purificadas a partir de precipitación con sulfato de amonio. Debido a su insensibilidad y poca interferencia por los aminoácidos libres, este ensayo es más útil para muestras de tejido completo y otras fuentes con alta concentración de proteínas. [4]

Procedimiento [ editar ]

Una muestra acuosa se trata con un volumen igual de base fuerte al 1% (hidróxido de sodio o potasio) seguido de unas gotas de sulfato de cobre (II) acuoso . Si la solución se vuelve violeta, contiene proteínas. Se pueden determinar entre 5 y 160 mg / ml . Los péptidos con la longitud correcta de al menos 3 aminoácidos son necesarios para un cambio de color significativo y medible con estos reactivos. [5]

Reactivo de Biuret [ editar ]

El reactivo de Biuret está hecho de hidróxido de sodio (NaOH) e hidratada de sulfato de cobre (II) , junto con tartrato de sodio y potasio , [6] el último de los cuales se añade a quelato y por lo tanto estabilizar los iones cúpricos. La reacción de los iones cúpricos con los átomos de nitrógeno implicados en los enlaces peptídicos conduce al desplazamiento de los átomos de hidrógeno del péptido en condiciones alcalinas. Una quelación tridentada o tetradentada con el péptido nitrógeno produce el color característico. Esto se encuentra con dipéptidos. [7]

El reactivo se usa comúnmente en el ensayo de proteínas biuret , una prueba colorimétrica que se usa para determinar la concentración de proteínas mediante espectroscopía UV / VIS a una longitud de onda de 540 nm.

Variantes de alta sensibilidad de la prueba de biuret [ editar ]

En el análisis colorimétrico moderno de péptidos se aplican comúnmente dos modificaciones importantes de la prueba de biuret: el análisis del ácido bicinconínico (BCA) y el análisis de Lowry. En estas pruebas, el Cu + formado durante la reacción de biuret reacciona más con otros reactivos, dando lugar a un color más intenso.

En la prueba de BCA , Cu + forma un complejo de color púrpura oscuro con ácido bicinconínico (BCA), [8] que absorbe alrededor de 562 nm, produciendo el característico color malva. El complejo BCA / cobre soluble en agua absorbe mucho más fuertemente que el complejo péptido / cobre, aumentando la sensibilidad de la prueba de biuret en un factor de alrededor de 100: el ensayo BCA permite detectar proteínas en el rango de 0,0005 a 2 mg / mL ). Además, el ensayo de proteínas BCA ofrece el importante beneficio de la compatibilidad con sustancias como, por ejemplo, hasta un 5% de tensioactivos en muestras de proteínas.

En el ensayo de proteínas de Lowry, el Cu + se oxida de nuevo a Cu 2+ por el Mo VI en el reactivo de Folin-Ciocalteu , que forma azul de molibdeno (Mo IV ). Los residuos de tirosina en la proteína también forman azul de molibdeno en estas circunstancias. De esta forma, se pueden detectar proteínas en concentraciones entre 0,005 y 2 mg / mL. [9] A su vez, el azul de molibdeno puede unir ciertos tintes orgánicos como el verde de malaquita y el Auramina O , lo que da como resultado una mayor amplificación de la señal. [10]

En Polonia , la prueba de biuret también se conoce como prueba de Piotrowski, en honor al fisiólogo polaco Gustaw Piotrowski (n. 1833), quien describió esta prueba en 1857. [11]

Referencias [ editar ]

  1. ^ "Definición de biuret | Dictionary.com" . www.dictionary.com . Consultado el 11 de marzo de 2021 .
  2. ↑ La reacción se observó por primera vez en 1833: Ferdinand Rose (1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metaloxyden" (Sobre los compuestos de albúmina con óxidos metálicos), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie , vol. 104, páginas 132-142, doi : 10.1002 / andp.18331040512 . Fue redescubierto de forma independiente en 1857 por un fisiólogo polaco: G. Piotrowski (1857) "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" (Una nueva reacción de proteínas y sus derivados relacionados) Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften en Wien, Mathischaften naturwissenschaftliche Classe (Actas de la Academia Imperial de Filosofías de Viena, sección de ciencias matemáticas y naturales), vol. 24, páginas 335-337.
  3. ^ Biblioteca de métodos de proteínas Thermo Scientific "Química del ensayo de proteínas". http://www.piercenet.com
  4. ↑ Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2009). Enfoques fundamentales de laboratorio para bioquímica y biotecnología . Wiley. pag. 111. ISBN 978-0470087664.
  5. ^ Fenk, CJ; Kaufman, N .; y Gerbig, DGJ Chem. Educ. 2007, 84, 1676-1678.
  6. ^ "Reactivos químicos" . Archivado desde el original el 13 de febrero de 2010 . Consultado el 30 de enero de 2010 .
  7. ^ Datta, SP; Leberman, R .; Rabin, BR (1959). "La quelación de iones metálicos por dipéptidos y sustancias relacionadas. Parte 5. — Complejos cúpricos de ligandos sarcosilo y leucilo" . Trans. Faraday Soc . 55 : 2141–2151. doi : 10.1039 / TF9595502141 . ISSN 0014-7672 . 
  8. ^ Smith, PK et al .: Medición de proteínas con ácido bicinconínico. Anal. Biochem. 150 (1985) 76-85.
  9. ^ OH Lowry, NJ Rosebrough, AL Farr, RJ Randall: Medición de proteínas con el reactivo de fenol de Folin, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265 - 275.
  10. ^ Sargent, MG: amplificación cincuenta veces mayor del ensayo de proteínas de Lowry. Anal. Biochem. 163 (1987) 476-481.
  11. ^ Dr. G. von Piotrowski (1857). "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" . Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Classe . 24 : 335-337.

Notas y enlaces externos [ editar ]

  • Oro. 1990. Organic Compounds in Biological Systems, 2ª ed. John Wiley & Sons, Inc.
  • Reactivos químicos