Un sistema libre de células es una herramienta in vitro ampliamente utilizada para estudiar las reacciones biológicas que ocurren dentro de las células además de un sistema celular completo, reduciendo así las complejas interacciones que se encuentran típicamente cuando se trabaja en una célula completa. [1] Las fracciones subcelulares se pueden aislar mediante ultracentrifugación para proporcionar maquinaria molecular que se puede utilizar en reacciones en ausencia de muchos de los otros componentes celulares. [2] Se han utilizado componentes internos de células eucariotas y procariotas para la creación de estos entornos simplificados. [3] [4] Estos sistemas han permitidoque surja la biología sintética , proporcionando control sobre qué reacción se está examinando, así como sobre su rendimiento, y disminuyendo las consideraciones que de otro modo se invocan cuando se trabaja con células vivas más sensibles. [5]
Tipos
Los sistemas sin células se pueden dividir en dos clasificaciones principales: basados en extractos de células, que eliminan componentes del interior de una célula para uso externo, y basados en enzimas purificadas, que utilizan componentes purificados de las moléculas que se sabe que participan en un proceso determinado. . [6] [7] El tipo basado en extracto celular es susceptible a problemas como la rápida degradación de componentes fuera de su anfitrión, como se muestra en un estudio de Kitaoka et al. donde un sistema de traducción libre de células basado en Escherichia coli ( E. coli ), del tipo basado en extracto celular, hizo que la plantilla de ARNm se degradara muy rápidamente y condujera a la interrupción de la síntesis de proteínas . [8]
Preparación
Los métodos de preparación varían entre situaciones de ambos tipos de sistemas libres de células.
Basado en extracto celular
Premio Nobel ganador Eduard Buchner fue posiblemente el primero en presentar un sistema libre de células usando levadura extractos, pero desde entonces se han encontrado fuentes alternativas. [9] [10] La E. coli , el germen de trigo y los reticulocitos de conejo han demostrado ser útiles para crear sistemas libres de células mediante la extracción de sus componentes internos. [3] [11] Se han adquirido extractos de E. coli 30S , por ejemplo, triturando las bacterias con alúmina , seguido de una limpieza adicional. [12] De manera similar, el germen de trigo se ha molido con arena lavada con ácido o vidrio en polvo para abrir las membranas celulares . [13] [14] Los reticulocitos de conejo se lisaron en una solución de MgCl 2 y el extracto se separó por filtración de las membranas mediante centrifugación. [15]
A base de enzimas purificadas
Pueden prepararse biosistemas de biotransformación de vía sintética sin células mezclando varias enzimas y coenzimas purificadas . [3] [16] Por ejemplo, los ribosomas estrechamente acoplados , que son compactos y muy activos, se han extraído y refinado de E. coli mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa . [17] [7]
Usos
Los biosistemas de biotransformación de vía sintética sin células se proponen como una nueva plataforma de biofabricación de bajo costo en comparación con la fermentación microbiana utilizada durante miles de años. [3] [16] Los biosistemas sin células tienen varias ventajas adecuadas para aplicaciones industriales: [6]
- Por lo general, se obtienen rendimientos de producto muy altos sin la formación de subproductos o la síntesis de masa celular. Por ejemplo, con una vía enzimática sintética, a partir de la reacción con almidón y agua.
- C 6 H 10 O 5 (l) + 7 H 2 O (l) → 12 H 2 (g) + 6 CO 2 (g),
- casi 12 H 2 ha sido producido por la glucosa unidad de polisacáridos y de agua , tres veces del rendimiento teórico de los mejores anaerobias hidrógeno productoras de microorganismos . [18]
- Los biosistemas in vitro pueden implementar algunas reacciones biológicas que los microbios vivos o los catalizadores químicos no pueden implementar antes. Por ejemplo, la celulosa con enlaces beta-1,4-glucosídicos se puede convertir en almidón con enlaces alfa-1,4-glucosídicos mediante una mezcla de enzimas intracelulares y extracelulares en un solo recipiente de reacción. [19]
- Los sistemas enzimáticos, sin la barrera de la membrana celular, suelen tener velocidades de reacción más rápidas que los sistemas microbianos. Por ejemplo, las pilas de combustible enzimáticas suelen tener una potencia mucho mayor que las pilas de combustible microbianas. [20]
- Los cócteles de enzimas pueden tolerar los compuestos tóxicos mejor que los microorganismos. [21]
- Las mezclas de enzimas suelen funcionar en condiciones de reacción amplias, como alta temperatura, pH bajo , presencia de disolventes orgánicos o líquidos iónicos . [dieciséis]
Síntesis de proteínas
Los biosistemas in vitro se pueden controlar y acceder fácilmente sin membranas. [16] En particular, en un trabajo que condujo a un premio Nobel, el experimento de Nirenberg y Matthaei utilizó un sistema libre de células, del tipo basado en extractos celulares, para incorporar aminoácidos seleccionados marcados radiactivamente en proteínas sintetizadas con 30S extraído de E. coli . [12] [22] Estudios más recientes, como el estudio realizado por Spirin et al. con la versión procariota y eucariota de su sistema de traducción libre de células, también han sintetizado proteínas con mayor producción, incorporando técnicas como el flujo continuo para agregar materiales y remover productos. [23] Con estos avances en el rendimiento, aplicaciones de productividad se han ampliado, tal como la síntesis de proteínas de fusión para servir potencialmente como vacunas para los linfomas de células B . [24] Además, la síntesis de proteínas sin células se está convirtiendo en una nueva opción alternativa para la síntesis rápida de proteínas. [6]
Manipulación metabólica
La ingeniería de los procesos metabólicos se ha logrado mediante sistemas libres de células. [25] [10] [3] Bujara y col. , por ejemplo, pudieron utilizar extractos de redes glucolíticas , que consisten en enzimas de E. coli que producen fosfato de dihidroxiacetona , para analizar en tiempo real las concentraciones de metabolitos mientras se alteran los niveles de enzima, con el resultado final de una producción óptima de fosfato de dihidroxiacetona . [26] Además, Calhoun y Swartz pudieron utilizar un intermedio glucolítico para alimentar un sistema sin células, lo que permitió una generación de ATP relativamente económica en comparación con el uso de reactivos en las reacciones de fosfoenolpiruvato . [27]
Incorporación de aminoácidos no naturales
También se han utilizado sistemas libres de células para incorporar aminoácidos no naturales . [27] [28] Shimizu y col. fueron capaces de cambiar un codón de terminación a un codón sentido omitiendo el factor de liberación de RF1 , lo que indica la capacidad de insertar los aminoácidos deseados en situaciones no naturales. Esto es útil en sistemas en los que trabajar dentro de una célula es problemático, como el proceso de metabolismo de los aminoácidos que previene el marcaje específico de los aminoácidos que sería útil en la espectroscopia de RMN multidimensional . [29] Kigawa y col. fueron capaces de etiquetar con éxito los aminoácidos en un sistema libre de células donde el metabolismo de los aminoácidos ya no estaba presente, lo que hace que dichos sistemas sean útiles para los estudios de RMN. [29]
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