Fragmentación (biología celular)
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En biología celular , formas en las que la fragmentación es útil para una célula: clonación de ADN y apoptosis. La clonación de ADN es importante en la reproducción asexual o la creación de moléculas de ADN idénticas, y la célula puede realizarla espontáneamente o intencionalmente los investigadores de laboratorio. La apoptosis es la destrucción programada de las células y las moléculas de ADN dentro de ellas, y es un proceso altamente regulado. Estas dos formas en que se usa la fragmentación en los procesos celulares describen las funciones celulares normales y los procedimientos de laboratorio comunes que se realizan con las células. Sin embargo, los problemas dentro de una célula a veces pueden causar fragmentación que resulta en irregularidades como la fragmentación de los glóbulos rojos y la fragmentación del ADN de los espermatozoides.

Clonación de ADN

La clonación de ADN puede ser realizada espontáneamente por la célula con fines reproductivos. Esta es una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se convierte en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (Ver fragmentación reproductiva ). La clonación de ADN también puede ser realizada intencionalmente por investigadores de laboratorio. Aquí, la fragmentación del ADN es una técnica de genética molecular que permite a los investigadores utilizar tecnología de ADN recombinante para preparar un gran número de moléculas de ADN idénticas. Para completar la clonación del ADN, es necesario obtener regiones pequeñas y discretas del ADN de un organismo que constituyan genes específicos.. Solo se pueden clonar moléculas de ADN relativamente pequeñas en cualquier vector disponible . Por lo tanto, las moléculas de ADN largas que componen el genoma de un organismo deben dividirse en fragmentos que puedan insertarse en el ADN del vector. [1] Dos enzimas facilitan la producción de tales moléculas de ADN recombinante:

1. Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son endonucleasas producidas por bacterias que normalmente reconocen secuencias de pares de bases pequeñas (llamadas sitios de restricción ) y luego escinden ambas cadenas de ADN en este sitio. [2] Un sitio de restricción es típicamente una secuencia palindrómica , lo que significa que la secuencia del sitio de restricción es la misma en cada hebra de ADN cuando se lee en la dirección 5 'a 3'.
Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima de modificación de modo que el propio ADN de la bacteria huésped está protegido de la escisión. Esto se hace modificando el ADN del huésped en o cerca de cada sitio de escisión potencial. La enzima de modificación agrega un grupo metilo a una o dos bases, y la presencia de este grupo metilo evita que la endonucleasa de restricción corte el ADN. [3]
A
Corte que crea un final pegajoso
A
Corte que crea un extremo romo
Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en las dos hebras de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera fragmentos con una "cola" de una sola hebra que sobresale en ambos extremos, denominada extremo pegajoso. Las enzimas de restricción también pueden hacer cortes rectos en las dos hebras de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera extremos romos. [4]
2. ADN ligasa
Durante la replicación normal del ADN, la ADN ligasa cataliza la unión (ligadura) de extremo a extremo de fragmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki . A los efectos de la clonación de ADN, se usa ADN ligasa purificada para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y el ADN del vector que tienen extremos complementarios. Se ligan covalentemente a través de los enlaces fosfodiéster estándar de 3 'a 5' del ADN. [5]
La ADN ligasa puede ligar extremos romos y pegajosos complementarios , pero la ligadura de extremos romos es ineficaz y requiere una mayor concentración de ADN y ligasa de ADN que la ligadura de extremos pegajosos. [6] Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN hacen cortes escalonados en las hebras de ADN para crear extremos pegajosos.

La clave para clonar un fragmento de ADN es vincularlo a una molécula de ADN vector que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Después de que se introduce una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado se puede replicar junto con el vector, generando una gran cantidad de moléculas de ADN idénticas. [7] El esquema básico para esto se puede resumir como sigue:

Vector + Fragmento de ADN
↓
ADN recombinante
↓
Replicación de ADN recombinante dentro de la célula huésped
↓
Aislamiento, secuenciación y manipulación de fragmentos de ADN purificados

Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio. [8]

Apoptosis

La fragmentación es el tercer y último paso del desmontaje celular durante la apoptosis (lado derecho del esquema). [9]

La apoptosis se refiere a la desaparición de las células por una forma específica de muerte celular programada , caracterizada por una secuencia bien definida de cambios morfológicos. [10] La contracción celular y nuclear, la condensación y fragmentación de la cromatina, la formación de cuerpos apoptóticos y la fagocitosis por células vecinas caracterizan los principales cambios morfológicos en el proceso de apoptosis. [11] Los cambios morfológicos y bioquímicos extensos durante la apoptosis aseguran que las células muertas dejen un impacto mínimo en las células y / o tejidos vecinos.

Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones distintas: [12]

  • Las proteínas "asesinas" son necesarias para que una célula comience el proceso apoptótico.
  • Las proteínas de "destrucción" hacen cosas como digerir el ADN en una célula moribunda
  • Las proteínas de "engrosamiento" son necesarias para la fagocitosis de la célula moribunda por otra célula.

La escisión del ADN cromosómico en fragmentos más pequeños es una parte integral y un sello bioquímico de la apoptosis. La apoptosis implica la activación de endonucleasas con posterior escisión del ADN de la cromatina en fragmentos de 180 pares de bases o múltiplos de 180 pares de bases (por ejemplo, 360, 540). Este patrón de fragmentación se puede utilizar para detectar apoptosis en pruebas como un ensayo de escalera de ADN con electroforesis en gel , un ensayo TUNEL o un ensayo Nicoletti . [13] La fragmentación apoptótica del ADN se basa en una enzima llamada DNasa activada por caspasa (CAD) . [14] La CAD generalmente es inhibida por otra proteína en la célula, llamadaInhibidor de DNasa activada por caspasa (ICAD) . [15] Para que comience la apoptosis, una enzima llamada caspasa 3 escinde ICAD para que el CAD se active. CAD luego escinde el ADN entre los nucleosomas , que se encuentran en la cromatina a intervalos de 180 pares de bases. Los sitios entre los nucleosomas son las únicas partes del ADN que están expuestas y accesibles a CAD. [dieciséis]

Irregularidades

La fragmentación del ADN puede ocurrir bajo ciertas condiciones en unos pocos tipos de células diferentes. Esto puede ocasionar problemas a una célula, o puede hacer que una célula reciba una señal para sufrir apoptosis. A continuación se muestran algunos ejemplos de fragmentación irregular que puede ocurrir en las células.

1. Fragmentación de glóbulos rojos
Frotis de sangre de un paciente con anemia hemolítica que muestra esquistocitos
Un glóbulo rojo fragmentado se conoce como esquistocito y generalmente es el resultado de una lesión mecánica intracelular del glóbulo rojo. [17] Se puede observar una amplia variedad de esquistocitos. Los esquistocitos generalmente se observan en cantidades relativamente bajas y se asocian con afecciones en las que el revestimiento endotelial normalmente liso, o endotelio , está rugoso o irregular, y / o la luz vascular está atravesada por hebras de fibrina . [18] Los esquistocitos se observan comúnmente en pacientes que tienen anemia hemolítica . También son una característica de la anemia por deficiencia de hierro avanzada., pero en este caso la fragmentación observada es probablemente el resultado de la fragilidad de las células producidas en estas condiciones.
2. Fragmentación del ADN de los espermatozoides
En un hombre promedio, menos del 4% de sus espermatozoides contendrán ADN fragmentado. Sin embargo, participar en comportamientos como fumar puede aumentar significativamente la fragmentación del ADN en los espermatozoides. Existe una correlación negativa entre el porcentaje de fragmentación del ADN y la motilidad, morfología y concentración de los espermatozoides. También existe una asociación negativa entre el porcentaje de espermatozoides que contienen ADN fragmentado y la tasa de fertilización y la tasa de escisión del embrión. [19]

Referencias

  1. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon y Matthew P. Scott. Biología celular molecular. 7ª ed. Nueva York: WH Freeman y, 2013. Imprimir.
  2. ^ Rao, Desirazu N., Swati Saha y Vinita Krishnamurthy. "Enzimas de restricción dependientes de ATP". Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 64 (2000): 1-63. Impresión.
  3. ^ Rao, Desirazu N., Swati Saha y Vinita Krishnamurthy. "Enzimas de restricción dependientes de ATP". Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 64 (2000): 1-63. Impresión.
  4. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon y Matthew P. Scott. Biología celular molecular. 7ª ed. Nueva York: WH Freeman y, 2013. Imprimir.
  5. ^ Tomkinson, Alan E. y Zachary B. Mackey. "Estructura y función de las ligasas de ADN de mamíferos". Investigación de mutaciones / reparación de ADN 407.1 (1998): 1-9. Impresión.
  6. ^ Hung, Mien-Chie y Pieter C. Wensink. "Diferentes extremos de ADN pegajosos generados por enzimas de restricción se pueden unir in vitro". Investigación de ácidos nucleicos 12.4 (1984): 1863-874. Impresión.
  7. ^ "Capítulo 20." Avonapbio /. Np, nd Web. 20 de noviembre de 2012. < http://avonapbio.pbworks.com/w/page/9429274/Ch%2020 >.
  8. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon y Matthew P. Scott. Biología celular molecular. 7ª ed. Nueva York: WH Freeman y, 2013. Imprimir.
  9. ^ Smith, Aaron; Parkes, Michael AF; Atkin-Smith, Georgia K; Tixeira, Rochelle; Poon, Ivan KH. "Desmontaje celular durante la apoptosis" . WikiJournal de Medicina . 4 (1). doi : 10.15347 / wjm / 2017.008 .
  10. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon y Matthew P. Scott. Biología celular molecular. 7ª ed. Nueva York: WH Freeman y, 2013. Imprimir.
  11. ^ Hua, Xhang J. y Ming Xu. "Fragmentación del ADN en la apoptosis". Cell Research 10 (2000): 205-11. Naturaleza. 17 de julio de 2000. Web. 19 de noviembre de 2012.
  12. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon y Matthew P. Scott. Biología celular molecular. 7ª ed. Nueva York: WH Freeman y, 2013. Imprimir.
  13. ^ Bortner, Carl D., Nicklas BE Oldenburg y John A. Cidlowski. "El papel de la fragmentación del ADN en la apoptosis". Trends in Cell Biology 5.1 (1995): 21-26. Impresión.
  14. ^ Jog, Neelakshi R., Lorenza Frisoni, Qin Shi, Marc Monestier, Sairy Hernandez, Joe Craft, Eline T. Luning Prak y Roberto Caricchio. "Se requiere ADNasa activada por caspasa para el mantenimiento de la tolerancia a los autoantígenos nucleares del lupus". Artritis y reumatismo 64.4 (2012): 1247-256. Impresión.
  15. ^ Kutscher, Daniel, Alfred Pingoud, Albert Jeltsch y Gregor Meiss. "Identificación de péptidos derivados de ICAD capaces de inhibir la ADNasa activada por caspasa". Revista FEBS 279.16 (2012): 2917-928. Impresión.
  16. ^ Bortner, Carl D., Nicklas BE Oldenburg y John A. Cidlowski. "El papel de la fragmentación del ADN en la apoptosis". Trends in Cell Biology 5.1 (1995): 21-26. Impresión.
  17. ^ Bessman, JD. "Fragmentación de glóbulos rojos. Mejor detección e identificación de causas". Revista Estadounidense de Patología Clínica 90.3 (1988): 268-73. Impresión.
  18. ^ "Esquistocitos". Esquistocitos. Np, nd Web. 20 de noviembre de 2012. < http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/rbcmorph/schisto.htm >.
  19. ^ Sun, JG, A. Jurisicova y RF Casper. "Detección de la fragmentación del ácido desoxirribonucleico en espermatozoides humanos: correlación con la fertilización in vitro". Biología de la reproducción 56.3 (1997): 602-07. Impresión.
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