Los extremos de ADN se refieren a las propiedades del extremo de las moléculas de ADN , que pueden ser pegajosas o desafiladas según la enzima que corta el ADN. La enzima de restricción pertenece a una clase más amplia de enzimas llamadas exonucleasas y endonucleasas. Las exonucleasas eliminan el nucleótido de los extremos, mientras que la endonucleasa corta en una posición específica dentro del ADN.
El concepto se utiliza en biología molecular , en la clonación o cuando la subclonación inserta ADN en el ADN del vector . Dichos extremos pueden generarse mediante enzimas de restricción que cortan el ADN: un corte escalonado genera dos extremos pegajosos, mientras que un corte recto genera extremos romos. [1]
Moléculas de ADN monocatenario
Una molécula de ADN no circular de una sola hebra tiene dos extremos no idénticos, el extremo 3 'y el extremo 5' (generalmente se pronuncia "tres extremos primarios" y "cinco extremos primarios"). Los números se refieren a la numeración de átomos de carbono en la desoxirribosa , que es un azúcar que forma una parte importante de la columna vertebral de la molécula de ADN. En la columna vertebral del ADN, el carbono 5 'de una desoxirribosa está unido al carbono 3' de otra mediante un enlace fosfodiéster. El carbono 5 'de esta desoxirribosa se une de nuevo al carbono 3' del siguiente, y así sucesivamente.
Variaciones en moléculas bicatenarias
Cuando una molécula de ADN es de doble hebra, como suele ser el ADN, las dos hebras corren en direcciones opuestas. Por lo tanto, un extremo de la molécula tendrá el extremo 3 'de la hebra 1 y el extremo 5' de la hebra 2, y viceversa en el otro extremo. Sin embargo, el hecho de que la molécula sea bicatenaria permite numerosas variaciones diferentes.
Extremos romos
El extremo de ADN más simple de una molécula de doble hebra se llama extremo romo . Los extremos romos también se conocen como extremos no cohesivos. En una molécula de extremos romos, ambas cadenas terminan en un par de bases . Los extremos romos no siempre son deseados en biotecnología, ya que cuando se usa una ADN ligasa para unir dos moléculas en una, el rendimiento es significativamente menor con extremos romos. Cuando se realiza la subclonación, también tiene la desventaja de poder insertar el inserto de ADN en la orientación opuesta deseada. Por otro lado, los extremos romos siempre son compatibles entre sí. Aquí hay un ejemplo de un pequeño fragmento de ADN de extremos romos:
5'- GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT -3 '3'- CTAGACTGACTACGCATACGATCA -5 '
Voladizos y extremos pegajosos
Los extremos no romos se crean mediante varios voladizos . Un saliente es un tramo de nucleótidos desapareados al final de una molécula de ADN. Estos nucleótidos no apareados pueden estar en cualquier hebra, creando proyecciones en 3 'o 5'. Estos voladizos son en la mayoría de los casos palindrómicos.
El caso más simple de un saliente es un solo nucleótido. Esta suele ser adenosina y se crea como un saliente 3 'por algunas ADN polimerasas . Más comúnmente, esto se usa en la clonación de productos de PCR creados por dicha enzima. El producto se une con una molécula de ADN lineal con un saliente de timina 3 ' . Dado que la adenina y la timina forman un par de bases , esto facilita la unión de las dos moléculas por una ligasa, produciendo una molécula circular. A continuación, se muestra un ejemplo de un voladizo en forma de A:
5'- ATCTGACTA -3 '3'- TAGACTGA -5 '
Los voladizos más largos se denominan extremos cohesivos o extremos pegajosos . La mayoría de las veces se crean mediante endonucleasas de restricción cuando cortan el ADN. Muy a menudo cortan las dos cadenas de ADN con cuatro pares de bases entre sí, creando un saliente 5 'de cuatro bases en una molécula y un saliente 5' complementario en la otra. Estos extremos se denominan cohesivos porque se vuelven a unir fácilmente mediante una ligasa.
Por ejemplo, estos dos extremos "adhesivos" son compatibles:
5'- ATCTGACT + GATGCGTATGCT -3 '3'- TAGACTGACTACG CATACGA -5 '
Pueden formar pares de bases complementarios en la región de voladizo:
GATGCGTATGCT -3 '5'- ATCTGACT CATACGA -5 '3'- TAGACTGACTACG
Además, dado que diferentes endonucleasas de restricción generalmente crean diferentes voladizos, es posible crear un plásmido escindiendo un fragmento de ADN (usando una enzima diferente para cada extremo) y luego uniéndolo a otra molécula de ADN con los extremos recortados por las mismas enzimas. Dado que los voladizos deben ser complementarios para que funcione la ligasa, las dos moléculas solo pueden unirse en una orientación. Esto es a menudo muy deseable en biología molecular .
Extremos deshilachados
Al otro lado de cada hebra única de ADN, normalmente vemos un par de adenina con timina y un par de citosina con guanina para formar una hebra complementaria paralela como se describe a continuación. Dos secuencias de nucleótidos que se corresponden entre sí de esta manera se denominan complementarias:
5'- ATCTGACT -3 '3'- TAGACTGA -5 '
Un extremo deshilachado se refiere a una región de una molécula de ADN bicatenaria (u otra multicatenaria) cerca del extremo con una proporción significativa de secuencias no complementarias; es decir, una secuencia en la que los nucleótidos de las hebras adyacentes no coinciden correctamente:
5'- ATCTGACTAGGCA -3 '3'- TAGACTGA CTACG -5 '
El término "deshilachado" se utiliza porque los nucleótidos mal emparejados tienden a evitar la unión, apareciendo así similares a las hebras en un trozo de cuerda deshilachado.
Aunque las secuencias no complementarias también son posibles en el medio del ADN de doble hebra, las regiones mal emparejadas alejadas de los extremos no se denominan "deshilachadas".
Descubrimiento
Ronald W. Davis descubrió por primera vez los extremos pegajosos como producto de la acción de EcoRI , la endonucleasa de restricción . [2]
Fuerza
Los enlaces finales adhesivos son diferentes en su estabilidad. La energía libre de formación se puede medir para estimar la estabilidad. Se pueden hacer aproximaciones de energía libre para diferentes secuencias a partir de datos relacionados con las curvas de desnaturalización térmica UV de oligonucleótidos. [3] También las predicciones de las simulaciones de dinámica molecular muestran que algunos enlaces finales pegajosos son mucho más fuertes en estiramiento que otros. [4]
Referencias
- Sambrook, Joseph ; David Russell (2001). Clonación molecular: un manual de laboratorio. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press , ISBN 0879695765 .
- ^ Sullivan, María. Ball . ISBN 9780544819016. OCLC 949423125 .
- ^ La página de inicio de la Fundación Gruber | La Fundación Gruber Archivado el 11 de mayo de 2012 en la Wayback Machine.
- ^ John SantaLucia Jr. (1997). "Una vista unificada de la termodinámica del vecino más cercano de ADN de polímero, mancuerna y oligonucleótido" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de EE . UU . 95 (4): 1460-1465. doi : 10.1073 / pnas.95.4.1460 . PMC 19045 . PMID 9465037 .
- ^ Ehsan Ban y Catalin R Picu (2014). "Fuerza de los enlaces finales adhesivos de ADN". Biomacromoléculas . 15 (1): 143-149. doi : 10.1021 / bm401425k . PMID 24328228 .