La toxina A de Clostridium difficile (TcdA) es una toxina generada por Clostridioides difficile , anteriormente conocido como Clostridium difficile . [1] Es similar a la toxina B de Clostridium difficile . Las toxinas son los principales factores de virulencia producidos por las bacterias gram positivas , anaerobias, [2] Clostridioides difficile . Las toxinas funcionan dañando la mucosa intestinal y causan los síntomas de la infección por C. difficile , incluida la colitis pseudomembranosa .
Toxina A | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | toxA | |||||
Alt. simbolos | tcdA | |||||
Entrez | 4914076 | |||||
RefSeq (Prot) | YP_001087137.1 | |||||
UniProt | P16154 | |||||
Otros datos | ||||||
Número CE | 2.4.1.- | |||||
Cromosoma | genoma: 0,79 - 0,81 Mb | |||||
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TcdA es una de las toxinas bacterianas más grandes conocidas. Con una masa molecular de 308 kDa, generalmente se describe como una enterotoxina potente , [3] pero también tiene cierta actividad como citotoxina . [4] La toxina actúa modificando las proteínas GTPasa de la célula huésped mediante glucosilación, lo que provoca cambios en las actividades celulares. Los factores de riesgo de la infección por C. difficile incluyen el tratamiento con antibióticos, que pueden alterar la microbiota intestinal normal y provocar la colonización de la bacteria C. difficile . [5]
gen tcdA
El gen contiene un marco de lectura abierto (ORF) de 8.133 nucleótidos , que codifica 2.710 aminoácidos . TcdA y TcdB comparten un 63% de homología en sus secuencias de aminoácidos. [6] Estos genes se expresan durante la fase logarítmica tardía y la fase estacionaria en respuesta a factores ambientales. Las tensiones ambientales, como los antibióticos y la represión de catabolitos, pueden influir en la expresión de la toxina. [7]
Locus de patogenicidad
Los genes tcdA y tcdB están situados en el cromosoma de Clostridioides difficile en un locus de patogenicidad de 19,6 kb (PaLoc) que se encuentra sólo en cepas toxigénicas de C. difficile . Las cepas no toxigénicas contienen un fragmento de 127 pares de bases que reemplaza al PaLoc. [8] Este locus también contiene otros tres genes accesorios tcdC , tcdR y tcdE . [9] La expresión de TcdC es alta durante la fase exponencial temprana y declina a medida que el crecimiento pasa a la fase estacionaria , de acuerdo con los aumentos en la expresión de tcdA y tcdB . Por consiguiente, los patrones de expresión han indicado a tcdC como un posible regulador negativo de la producción de toxinas. tcdR puede servir como un regulador positivo de la producción de toxinas. [7] Se ha especulado que la tcdE facilita la liberación de TcdA y TcdB a través de la actividad lítica en la membrana celular bacteriana. Debido a su homología con otras proteínas de función similar, así como a la ubicación del gen entre tcdA y tcdB , se predice que tcdE funcionará como la proteína lítica que facilita la liberación ya que TcdA y TcdB carecen de un péptido señal para la secreción . [8]
Estructura
La proteína contiene tres dominios. El dominio amino N-terminal contiene el sitio activo , responsable de la actividad glucosilante de la toxina. Tanto TcdA como TcdB usan esta región N-terminal altamente conservada (74% de homología entre ambas toxinas) para alterar sustratos idénticos . [7]
El dominio carboxi C-terminal contiene unidades repetidas que son responsables de la unión del receptor en las superficies de las células diana. Estas unidades repetitivas homólogas cortas se han denominado oligopéptido repetitivo combinado (CROP). [7] [10] Un estudio reciente demuestra que los CROPs determinan la potencia de TcdA a través de interacciones con estructuras en la superficie celular. [11] Estas regiones CROP varían de 21 a 50 residuos y juegan un papel en la unión del receptor. [7] Esta región repetitiva C-terminal se designa como región inmunomodominante ya que la unión del ligando puede ser bloqueada por anticuerpos monoclonales específicos de esta región. [12] [13] Esta región contiene la porción más hidrófila de la molécula. [10]
Se cree que un dominio hidrofóbico ubicado centralmente que contiene un grupo de 172 aminoácidos hidrofóbicos altamente conservados es importante para la translocación de la porción enzimática de la proteína. [5] [6]
Mecanismo de acción
TcdA debe internalizarse en la célula huésped mediante endocitosis para acceder al citosol . La unión del receptor es el primer paso necesario para entrar en la célula a través de la endocitosis en un endosoma ácido . [6] El pH bajo en el endosoma induce cambios estructurales como la exposición de los dominios hidrofóbicos que son cruciales para la función de TcdA. [7] [14]
El dominio N-terminal de TcdA funciona para catalizar una reacción de glucotransferasa, que transfiere una molécula de glucosa de UDP-Glucosa y la une covalentemente a los aminoácidos conservados en las moléculas diana. [6] Por lo tanto, TcdA cataliza la glucosilación y la subsiguiente inactivación irreversible de moléculas diana en la familia Ras de pequeñas GTPasas. [9] Estas moléculas diana incluyen RhoA , Rac y Cdc42 , que son proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina eucariota y moduladores de muchas vías de señalización celular. [7]
Dianas intracelulares
TcdA se dirige principalmente a Rho , Rac y Cdc42 . Estas moléculas son importantes reguladores de la señalización celular. Pequeñas GTPasas como Rho, Rac y Cdc42 regulan su actividad alternando entre un estado activo ligado a GTP y un estado inactivo ligado a GDP . [7] Los factores de intercambio de guanina (FMAM) regulan el intercambio de GTP y PIB . [15]
TcdA glucosila RhoA transfiriendo una molécula de glucosa de UDP-glucosa , un azúcar nucleótido, a Thr-37 de la RhoA GTPasa. En Rac y Cdc42 , el resto de azúcar se transfiere al Thr-35. La glucosilación previene la unión adecuada de GTP y bloquea la activación. [7] TcdA actúa preferentemente sobre la forma unida a GDP de las proteínas GTPasa ya que esta configuración expone el residuo de treonina que es glucosilado por la toxina. [5]
RhoA regula el citoesqueleto de actina y forma fibras de tensión y adherencias focales . [16] Cuando RhoA se inactiva a través de TcdA, se inhibe su interacción con los efectores posteriores . Esto conduce a cambios en el citoesqueleto de actina que aumentan la permeabilidad del epitelio intestinal . Rac y Cdc42 están involucrados en la formación de filopodios crucial para el movimiento y la migración celular. En general, Rho , Rac y Cdc42 regulan los procesos en las células que dependen de la polimerización de actina. Muchos de los efectos fisiológicos que experimentan las células después de la exposición a TcdA pueden estar relacionados con la falta de regulación de la polimerización de actina y las vías celulares controladas por dianas de TcdA. [7]
Efectos fisiológicos
Morfología celular
La exposición a TcdA conduce a cambios inmediatos en la morfología celular, incluida la pérdida de la integridad estructural debido a una disminución de la actina filamentosa ( F-actina ) y un aumento de la actina globular . [17] La desorganización de los filamentos de actina y el citoesqueleto conduce a una mayor permeabilidad de las uniones estrechas, lo que da como resultado un daño severo de las células epiteliales y la secreción de líquidos. [18] [19] La acumulación y secreción de líquido son secundarias al daño de la mucosa que ocurre después de la exposición a TcdA. Distintos cambios en el sistema de microfilamentos conducen al redondeo y muerte celular. [17] Estos cambios son el resultado de la inactivación de las proteínas Rho , que desempeñan un papel importante en la regulación de las uniones estrechas . [7] [20]
Apoptosis
La apoptosis es el mecanismo más probable que explica la muerte de las células expuestas a TcdA. La inactivación de Rho puede activar caspasa-3 y caspasa-9 ; dos componentes clave de la vía apoptótica. La TcdA se ha relacionado con la alteración de la membrana mitocondrial y la liberación de citocromo C a través de la activación de la caspasa y la inactivación de Rho , lo que sugiere además que la TcdA es capaz de inducir la apoptosis. [21] [22]
Significación clínica
Diarrea asociada a Clostridioides difficile (DACD)
Los modelos animales han demostrado que TcdA incluye diarrea, infiltración de neutrófilos , inflamación de la mucosa intestinal y necrosis de las células epiteliales . Esta toxina se considera la principal causa de CDAD. [18] TcdA daña las puntas de las vellosidades intestinales, lo que altera la membrana del borde en cepillo , lo que provoca la erosión celular y la fuga de líquido del área dañada. Este daño y la respuesta de líquidos asociada causan la diarrea asociada con la infección por Clostridioides difficile . [17]
Colitis pseudomembranosa
La TcdA puede inducir los cambios fisiológicos que se producen en la colitis pseudomembranosa (PMC) relacionada con C. difficile , una ulceración grave del colon. El daño de la toxina en la mucosa del colon promueve la acumulación de fibrina , mucina y células muertas para formar una capa de desechos en el colon (pseudomembrana), lo que provoca una respuesta inflamatoria . [5] El daño de TcdA causa aumento de la permeabilidad epitelial, producción de citocinas y quimiocinas , infiltración de neutrófilos, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), activación de mastocitos y daño directo a la mucosa intestinal. [23] Todo puede atribuirse a la inactivación inducida por TcdA de las proteínas Rho GTPasa . [20] La pérdida de uniones estrechas puede proporcionar la entrada de neutrófilos a los intestinos, lo que lleva a la acumulación de neutrófilos; un sello distintivo de PMC. La producción de citocinas inducida por TcdA de IL-8 y otros mediadores inflamatorios contribuye a las etapas de inflamación observadas en la PMC. La infiltración de neutrófilos, macrófagos y mastocitos en respuesta al daño de TcdA aumenta la respuesta inflamatoria a través de la producción y liberación de otros mediadores como el factor de necrosis tumoral alfa , IL-1 , IL-6 y otras monoquinas . Estos mediadores causan daño adicional a la mucosa intestinal y aumentan aún más la respuesta inflamatoria, lo que influye en la persistencia de la PMC. [24] Si se produce un daño extenso en la pared intestinal, las bacterias pueden ingresar al torrente sanguíneo y causar un shock séptico y la muerte. [5]
Detección y diagnóstico de toxinas
TcdA y TcdB están presentes en los fluidos sobrenadantes de cultivos de Clostridium difficile y pueden purificarse a partir de filtrados. Ambas toxinas se detectan constantemente en muestras fecales de seres humanos y animales [25] y ahora se utilizan como marcadores para diagnosticar la infección por C. difficile . [7] Se encontró que más del 90% de los pacientes infectados con C. difficile tenían actividad citotóxica en las heces. La glucosilación de Rho GTPasas inactiva las proteínas GTPasa, lo que conduce al colapso del citoesquelton, lo que da como resultado un redondeo celular. Se ha desarrollado un ensayo de cultivo de tejidos para detectar toxinas de C. difficile en muestras de heces. [17] Se ha desarrollado un ensayo de redondeo celular (ensayo de citotoxicidad) para diagnosticar la infección por C. difficile . [11] Se han utilizado ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para detectar TcdA y TcdB con anticuerpos específicos . Cuando se usa con un ELISA, el ensayo de citotoxicidad es el "estándar de oro" cuando se usa en células Vero para el diagnóstico de C. difficile . [11]
Importancia de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile
Desde la década de 1980 y principios de la de 1990, las funciones de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile se han debatido mucho. Los informes anteriores con toxinas purificadas indicaron que TcdA solo era suficiente para causar síntomas de infección y TcdB no pudo hacerlo a menos que se combinara con TcdA. [7] Un experimento más reciente indicó que TcdB era, de hecho, esencial para la virulencia . [26] Investigaciones anteriores establecieron a la TcdA estrictamente como una enterotoxina y la TcdB como una citotoxina , pero más tarde se descubrió que ambas toxinas tenían el mismo mecanismo de acción. [6] Para investigar completamente el papel de ambas toxinas en la patogénesis de la infección por C. difficile , se desarrolló un sistema de eliminación de genes en un modelo de infección de hámster. Al anular permanentemente tcdA , tcdB o ambos (doble anulación ), se demostró que C. difficile, que produce una o ambas toxinas, es capaz de tener actividad citotóxica, y esta actividad se traduce directamente en virulencia in vivo . También se encontró que un doble knockout de tcdAtcdB estaba completamente atenuado en virulencia . En general, esta investigación ha demostrado la importancia de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile , lo que demuestra que cualquiera de las toxinas es capaz de producir citotoxicidad. [9]
Ver también
- Clostridium difficile TcdE Holin
- Holin
Referencias
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