Análisis de cuna
El análisis C0t , una técnica basada en los principios de la cinética de reasociación del ADN , es una técnica bioquímica que mide cuánto ADN repetitivo hay en una muestra de ADN, como un genoma . [1] Se utiliza para estudiar la estructura y organización del genoma y también se ha utilizado para simplificar la secuenciación de genomas que contienen grandes cantidades de secuencias repetitivas. [2]
El procedimiento consiste en calentar una muestra de ADN genómico hasta que se desnaturalice en la forma de una sola hebra y luego enfriarla lentamente para que las hebras puedan volver a emparejarse. Mientras la muestra se enfría, se toman medidas de la cantidad de ADN que tiene pares de bases a cada temperatura.
La cantidad de ADN monocatenario y bicatenario se mide diluyendo rápidamente la muestra, lo que ralentiza la reasociación, y luego uniendo el ADN a una columna de hidroxiapatita . La columna se lava primero con una baja concentración de tampón de fosfato de sodio , que eluye el ADN monocatenario, y luego con altas concentraciones de fosfato, que eluye el ADN bicatenario. Luego se mide la cantidad de ADN en estas dos soluciones usando un espectrofotómetro .
Dado que una secuencia de ADN monocatenario necesita encontrar su cadena complementaria para reformar una doble hélice, las secuencias comunes se renaturalizan más rápidamente que las secuencias raras. De hecho, la velocidad a la que se reasociará una secuencia es proporcional al número de copias de esa secuencia en la muestra de ADN. Una muestra con una secuencia altamente repetitiva se renaturalizará rápidamente, mientras que las secuencias complejas se renaturalizarán lentamente.
Sin embargo, en lugar de medir simplemente el porcentaje de ADN de doble cadena frente al tiempo, la cantidad de renaturalización se mide en relación con un valor de C0t . El valor C 0 t es el producto de C 0 (la concentración inicial de ADN), t (tiempo en segundos) y una constante que depende de la concentración de cationes en el tampón. El ADN repetitivo se renaturalizará a valores bajos de C 0 t, mientras que las secuencias de ADN únicas y complejas se renaturalizarán a valores altos de C 0 t. La rápida renaturalización del ADN repetitivo se debe a la disponibilidad de numerosas secuencias complementarias.
La filtración C 0 t es una técnica que utiliza los principios de la cinética de renaturalización del ADN para separar las secuencias de ADN repetitivas que dominan muchos genomas eucariotas de las secuencias de copia simple/baja "ricas en genes". [2] Esto permite que la secuenciación del ADN se concentre en las partes del genoma que son más informativas e interesantes, lo que acelerará el descubrimiento de nuevos genes y hará que el proceso sea más eficiente. [3] [4]
