Recombinación Cre-Lox
La recombinación Cre-Lox es una tecnología de recombinasa específica del sitio , utilizada para llevar a cabo deleciones , inserciones , translocaciones e inversiones .en sitios específicos en el ADN de las células. Permite que la modificación del ADN se dirija a un tipo de célula específico o se desencadene por un estímulo externo específico. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procariotas. El sistema de recombinación Cre-lox ha sido particularmente útil para ayudar a los neurocientíficos a estudiar el cerebro en el que se unen tipos de células y circuitos neuronales complejos para generar cognición y comportamientos. NIH Blueprint for Neuroscience Research ha creado varios cientos de líneas de ratones controladores Cre que actualmente utiliza la comunidad neurocientífica mundial.
El sistema consta de una sola enzima, Cre recombinasa , que recombina un par de secuencias objetivo cortas llamadas secuencias Lox . Este sistema se puede implementar sin insertar proteínas o secuencias de soporte adicionales. La enzima Cre y el sitio Lox original denominado secuencia LoxP se derivan del bacteriófago P1 .
La ubicación adecuada de las secuencias Lox permite que los genes se activen, repriman o intercambien por otros genes. A nivel de ADN se pueden realizar muchos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima Cre se puede controlar para que se exprese en un tipo de célula en particular o se active por un estímulo externo como una señal química o un golpe de calor. Estos cambios de ADN dirigidos son útiles en el rastreo del linaje celular y cuando los mutantes son letales si se expresan globalmente.
La recombinación Cre-Lox es un tipo especial de recombinación específica del sitio desarrollada por el Dr. Brian Sauer y patentada por DuPont que operaba tanto en células mitóticas como no mitóticas, y se usó inicialmente para activar la expresión génica en líneas celulares de mamíferos. [2] [3] [4] Posteriormente, los investigadores del laboratorio del Dr. Jamey Marthdemostró que la recombinación Cre-Lox podría usarse para eliminar secuencias de ADN cromosómico flanqueadas por loxP con alta eficiencia en células T en desarrollo específicas de animales transgénicos, y los autores propusieron que este enfoque podría usarse para definir la función de genes endógenos en tipos de células específicos, marcar de forma indeleble a los progenitores en los estudios de determinación del destino celular, inducir reordenamientos cromosómicos específicos para el modelado biológico y de enfermedades, y determinar las funciones de las lesiones genéticas tempranas en el mantenimiento de enfermedades (y fenotipos). [5]
Poco después, los investigadores del laboratorio del Prof. Klaus Rajewsky informaron sobre la producción de células madre embrionarias pluripotentes que portaban un gen de ADN polimerasa flanqueado por loxP (floxed). [6] Combinando estos avances en colaboración, los laboratorios de los Dres. Marth y Rajewsky informaron en 1994 que la recombinación Cre-lox podría usarse para la selección condicional de genes. [7] Observaron que ≈50 % del gen beta de la ADN polimerasa se eliminó en las células T según la transferencia de ADN. No estaba claro si solo un alelo en cada célula T o el 50 % de las células T tenían una eliminación del 100 % en ambos alelos. Desde entonces, los investigadores informaron una mutagénesis genética condicional Cre-Lox más eficiente en las células T en desarrollo por parte del laboratorio Marth en 1995. [8] Eliminación incompleta porCre recombinase no es infrecuente en células cuando existen dos copias de secuencias floxed, y permite la formación y estudio de tejidos quiméricos. Se ha demostrado que todos los tipos de células probados en ratones se someten a una recombinación Cre transgénica.
Independientemente, Joe Z. Tsien ha sido pionero en el uso del sistema Cre-loxP para la manipulación de genes específicos de regiones y tipos de células en el cerebro adulto, donde pueden existir cientos de tipos distintos de neuronas y se sabe que casi todas las neuronas del cerebro adulto son posteriores. -mitótico. [9] Tsien y sus colegas demostraron que la recombinación mediada por Cre puede ocurrir en las neuronas piramidales posmitóticas en el cerebro anterior del ratón adulto. [10]
