Las tecnologías de recombinasa específicas del sitio son herramientas de ingeniería del genoma que dependen de las enzimas recombinasas para reemplazar secciones específicas de ADN.
Historia
A finales de la década de 1980, la selección de genes en células madre embrionarias murinas (ESC) permitió la transmisión de mutaciones a la línea germinal del ratón y surgió como una opción novedosa para estudiar la base genética de las redes reguladoras tal como existen en el genoma. Aún así, el direccionamiento genético clásico demostró estar limitado de varias maneras, ya que las funciones genéticas fueron destruidas irreversiblemente por el gen marcador que tuvo que introducirse para seleccionar las ESC recombinantes. Estos primeros pasos llevaron a animales en los que la mutación estaba presente en todas las células del cuerpo desde el principio, lo que condujo a fenotipos complejos y / o letalidad temprana. Había una clara necesidad de métodos para restringir estas mutaciones a puntos específicos del desarrollo y tipos celulares específicos. Este sueño se hizo realidad cuando grupos en los EE. UU. Pudieron introducir sistemas de recombinación específica de sitio (SSR) y bacteriófagos derivados de levadura en células de mamíferos y en ratones. [1] [2] [3]
Clasificación, propiedades y aplicaciones dedicadas
Las estrategias comunes de ingeniería genética requieren una modificación permanente del genoma objetivo. Con este fin, se debe invertir una gran sofisticación en el diseño de rutas aplicadas para la entrega de transgenes. Aunque para fines biotecnológicos la integración aleatoria sigue siendo común, puede resultar en una expresión génica impredecible debido a la cantidad variable de copias del transgén, la falta de control sobre los sitios de integración y las mutaciones asociadas. Los requisitos moleculares en el campo de las células madre son mucho más estrictos. Aquí, la recombinación homóloga (HR) puede, en principio, proporcionar especificidad al proceso de integración, pero para los eucariotas se ve comprometida por una eficiencia extremadamente baja. Aunque las meganucleasas, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción y dedos de zinc (ZFN y TALEN) son herramientas reales que respaldan la HR, fue la disponibilidad de recombinasas específicas de sitio (SSR) lo que desencadenó la construcción racional de líneas celulares con propiedades predecibles. En la actualidad, ambas tecnologías, HR y SSR, se pueden combinar en "tecnologías de etiquetado e intercambio" altamente eficientes. [4]
Se han identificado muchos sistemas de recombinación específicos de sitio para realizar estos reordenamientos de ADN para una variedad de propósitos, pero casi todos pertenecen a cualquiera de dos familias, tirosina recombinasas (YR) y serina recombinasas (SR), dependiendo de su mecanismo . Estas dos familias pueden mediar hasta tres tipos de reordenamientos del ADN (integración, escisión / resolución e inversión) a lo largo de diferentes rutas de reacción según su origen y arquitectura. [5]
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El miembro fundador de la familia YR es la lambda integrasa , codificada por el bacteriófago λ , que permite la integración del ADN del fago en el genoma bacteriano. Una característica común de esta clase es un nucleófilo de tirosina conservado que ataca el ADN-fosfato escindible para formar un enlace 3'-fosfotirosina. Los primeros miembros de la familia SR están estrechamente relacionados con las invertasas resolvasas / ADN de los transposones bacterianos Tn3 y γδ, que dependen de una serina catalítica responsable de atacar el fosfato escindible para formar un enlace 5'-fosfoserina. Estos hechos indiscutibles, sin embargo, se vieron comprometidos por una gran confusión en el momento en que otros miembros entraron en escena, por ejemplo, las recombinasas YR Cre y Flp (capaces de integración, escisión / resolución así como inversión), que sin embargo fueron bien recibidas como nuevos miembros de la "familia integrase". Los ejemplos inversos son PhiC31 y SR relacionados, que se introdujeron originalmente como resolvasas / invertasas aunque, en ausencia de factores auxiliares, la integración es su única función. Actualmente la actividad estándar de cada enzima determina su clasificación reservando el término general "recombinasa" para los miembros de la familia que, per se, comprenden las tres rutas, INT, RES e INV:
Nuestra tabla amplía la selección de los sistemas SSR convencionales y los agrupa según su rendimiento. Todas estas enzimas recombinan dos sitios diana, que son idénticos (subfamilia A1) o distintos (enzimas derivadas de fagos en A2, B1 y B2). [6] Mientras que para A1 estos sitios tienen designaciones individuales (" FRT " en el caso de Flp-recombinasa, loxP para Cre-recombinasa), los términos " att P" y " att B" (sitios de unión en el fago y la parte bacteriana, respectivamente) son válidas en los demás casos. En el caso de la subfamilia A1, tenemos que tratar con sitios cortos (generalmente de 34 pb-) que constan de dos brazos de 13 pb (casi) idénticos (flechas) que flanquean un espaciador de 8 pb (la región de cruce, indicada por dobletes de línea roja). [7] Tenga en cuenta que para Flp hay un sitio alternativo de 48 pb disponible con tres brazos, cada uno con una unidad de Flp (un llamado "protómero"). Los sitios att P y att B siguen reglas arquitectónicas similares, pero aquí los brazos muestran solo una identidad parcial (indicada por las líneas discontinuas) y difieren en ambos casos. Estas características dan cuenta de diferencias relevantes:
- la recombinación de dos sitios de educto idénticos conduce a sitios de producto con la misma composición, aunque contienen brazos de ambos sustratos; estas conversiones son reversibles;
- en el caso de att P x att B, los cruces de recombinación solo pueden ocurrir entre estos socios complementarios en procesos que conducen a dos productos diferentes ( att P x att B → att R + att L) de manera irreversible.
Para agilizar este capítulo, las siguientes implementaciones se centrarán en dos recombinasas (Flp y Cre) y una sola integrasa (PhiC31), ya que su espectro cubre las herramientas que, en la actualidad, se utilizan principalmente para modificaciones genómicas dirigidas. Esto se hará en el marco de la siguiente descripción general.
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Rutas de reacción
El modo de integración / resolución e inversión (INT / RES e INV) dependen de la orientación de los sitios diana de recombinasa (RTS), entre estos pares de att P y att B. La sección C indica, de manera simplificada, la forma en que la recombinasa media El intercambio de casetes (RMCE) se puede alcanzar mediante cruces síncronos recíprocos dobles (en lugar de integración, seguida de resolución). [8] [9]
Las Tyr-Recombinasas son reversibles, mientras que la Ser-Integrasa es unidireccional. Es de destacar la forma en que la integración / resolución de Flp reversible (una recombinasa de Tyr) se modula mediante versiones FRT de 48 pb (en lugar de un mínimo de 34 pb) : el brazo adicional de 13 pb sirve como una "ruta de aterrizaje" de Flp que contribuye a la formación de la complejo sináptico, tanto en el contexto de las funciones Flp-INT como Flp-RMCE (ver las respectivas situaciones de equilibrio). Si bien es apenas posible prevenir la reversión (impulsada por la entropía) de la integración en la sección A para Cre y difícil de lograr para Flp, RMCE se puede completar si el plásmido donante se proporciona en exceso debido al carácter bimolecular de ambos - y la reacción inversa. La colocación de ambos sitios FRT de manera inversa conducirá a un equilibrio de ambas orientaciones para el inserto (flecha verde). En contraste con Flp, la Ser integrasa PhiC31 (representaciones de la parte inferior) conduce a la integración unidireccional, al menos en ausencia de un factor de direccionalidad recombinasa (RDF-). [10] En relación con Flp-RMCE, que requiere dos mutantes de espaciador FRT diferentes ("heteroespecíficos") , el socio de reacción ( att B) del primer sitio att P que reacciona se golpea arbitrariamente, de modo que no hay control sobre la dirección el casete del donante entra en el objetivo (véanse los productos alternativos). También diferente de Flp-RMCE , varios objetivos RMCE distintos no pueden montarse en paralelo, debido a la falta de combinaciones att P / att B heteroespecíficas (sin interacción cruzada) .
Cre recombinasa
Cre recombinasa (Cre) es capaz de recombinar secuencias específicas de ADN sin necesidad de cofactores . La enzima reconoce secuencias de ADN de 34 pares de bases llamadas loxP ("lugar de cruce en el fago P1"). Dependiendo de la orientación de los sitios diana entre sí, Cre integrará / escindirá o invertirá las secuencias de ADN. Tras la escisión (denominada "resolución" en el caso de un sustrato circular) de una región de ADN particular, la expresión génica normal se ve considerablemente comprometida o terminada. [11]
Debido a la pronunciada actividad de resolución de Cre, una de sus aplicaciones iniciales fue la escisión de genes flanqueados por lox P ("floxados") que conducen a la eliminación del gen específico de la célula de dicho gen floxado después de que Cre se expresa en el tejido de interés. Las tecnologías actuales incorporan métodos que permiten el control tanto espacial como temporal de la actividad de Cre. Un método común que facilita el control espacial de la alteración genética implica la selección de un promotor específico de tejido para impulsar la expresión de Cre. La colocación de Cre bajo el control de tal promotor da como resultado una expresión localizada específica de tejido. Como ejemplo, Leone et al. han colocado la unidad de transcripción bajo el control de las secuencias reguladoras del gen de la proteína proteolípida de mielina (PLP), lo que lleva a la eliminación inducida de secuencias de genes diana en oligodendrocitos y células de Schwann . [12] El fragmento de ADN específico reconocido por Cre permanece intacto en las células que no expresan el gen PLP; esto a su vez facilita la observación empírica de los efectos localizados de las alteraciones del genoma en la vaina de mielina que rodea las fibras nerviosas en el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). [13] La expresión selectiva de Cre también se ha logrado en muchos otros tipos de células y tejidos.
Para controlar la actividad temporal de la reacción de escisión, se han desarrollado formas de Cre que aprovechan varios dominios de unión de ligandos . Una estrategia exitosa para inducir la actividad Cre temporal específica implica fusionar la enzima con un dominio de unión a ligando mutado para el receptor de estrógeno humano (ERt). Tras la introducción del tamoxifeno (un antagonista del receptor de estrógeno ), la construcción Cre-ERt puede penetrar el núcleo e inducir una mutación dirigida. ERt se une al tamoxifeno con mayor afinidad que los estrógenos endógenos , lo que permite que Cre-ERt permanezca citoplasmático en animales no tratados con tamoxifeno. El control temporal de la actividad SSR por el tamoxifeno permite que los cambios genéticos se induzcan posteriormente en la embriogénesis y / o en los tejidos adultos. [12] Esto permite a los investigadores evitar la letalidad embrionaria sin dejar de investigar la función de genes específicos.
Extensiones recientes de estos conceptos generales llevaron a generar el "Cre-zoo", es decir, colecciones de cientos de cepas de ratón para las que se pueden eliminar genes definidos mediante la expresión de Cre dirigida. [3]
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Recombinasa de flp
En su hospedador natural (S. cerevisiae), el sistema Flp / FRT permite la replicación de un "plásmido 2μ" mediante la inversión de un segmento que está flanqueado por dos sitios FRT idénticos, pero orientados de manera opuesta (actividad "flippasa"). Esta inversión cambia la orientación relativa de las horquillas de replicación dentro del plásmido, lo que permite el "círculo rodante", la amplificación de la entidad circular de 2 μ antes de que los intermedios multiméricos se resuelvan para liberar múltiples productos monoméricos. Mientras que los sitios FRT mínimos de 34 pb favorecen la escisión / resolución en un grado similar a los sitios lox P análogos para Cre, las variantes de FRT de 48 pb naturales más extendidas permiten un mayor grado de integración, mientras superan ciertas interacciones promiscuas como se describe para enzimas de fagos como Cre- [5] y PhiC31. [6] Una ventaja adicional es el hecho de que se pueden aplicar reglas simples para generar sitios FRT heteroespecíficos que se cruzan con socios iguales pero no con FRT de tipo salvaje . Estos hechos han permitido, desde 1994, el desarrollo y el perfeccionamiento continuo de las estrategias de intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE-) que permiten el intercambio limpio de un casete diana por un casete de donante entrante. [6]
Basado en la tecnología RMCE, un recurso particular de cepas ES pre-caracterizadas que se presta a una mayor elaboración ha evolucionado en el marco del programa EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagénesis), basado en el ahora establecido Cre- y / o Flp- configuraciones basadas en "FlExing" (escisión / inversión mediada por Flp), [6] que implican las actividades de escisión e inversión. Iniciado en 2005, este proyecto se centró primero en la mutagénesis de saturación para permitir la anotación funcional completa del genoma del ratón (coordinado por el Consorcio Internacional Knockout-Mouse, IKMC) con el objetivo final de que todos los genes de las proteínas mutaran a través de la captura y selección de genes en murinos. Células madre embrionarias. [14] Estos esfuerzos marcan la cima de varias estrategias de "etiquetado e intercambio", que se dedican a etiquetar un sitio genómico distinto de manera que la "etiqueta" pueda servir como una dirección para introducir información genética nueva (o alterar la existente). El paso de etiquetado per se puede abordar ciertas clases de sitios de integración explotando las preferencias de integración de retrovirus o incluso integrasas específicas de sitio como PhiC31, las cuales actúan de una manera esencialmente unidireccional.
Los tradicionales y laboriosos procedimientos de "etiquetado e intercambio" se basaban en dos pasos sucesivos de recombinación homóloga (HR-), el primero ("HR1") para introducir una etiqueta que constaba de un gen marcador de selección. Luego se usó "HR2" para reemplazar el marcador por el "GOI. En la primera reacción (" knock-out "-), el gen se etiquetó con un marcador seleccionable, generalmente mediante la inserción de un casete higtk ([+/-]) proporcionando resistencia a G418. En el siguiente paso de "knock-in", la secuencia genómica etiquetada se reemplazó por secuencias genómicas homólogas con ciertas mutaciones. Los clones celulares podrían aislarse por su resistencia al ganciclovir debido a la pérdida del gen HSV-tk, es decir ("selección negativa") Este procedimiento convencional de etiquetado e intercambio de dos pasos [15] podría simplificarse después de la llegada de RMCE, que podría asumir el control y agregar eficiencia al paso de knock-in.
Integrasa PhiC31
Sin mucha duda, las integraas de Ser son las herramientas de elección actuales para integrar transgenes en un número restringido de sitios aceptores genómicos bien entendidos que en su mayoría (pero no siempre) imitan el sitio att P del fago en el sentido de que atraen un vector donante que contiene att B . En este momento, el miembro más destacado es PhiC31-INT con un potencial probado en el contexto de los genomas humanos y de ratón.
Al contrario de las recombinasas de Tyr anteriores, PhiC31-INT como tal actúa de manera unidireccional, bloqueando firmemente el vector donante en una diana anclada genómicamente. Una ventaja obvia de este sistema es que puede depender de sitios donantes att P (aceptor) y att B nativos no modificados . Pueden surgir beneficios adicionales (junto con ciertas complicaciones) del hecho de que los genomas humanos y de ratón contienen per se un número limitado de dianas endógenas (los denominados " pseudositios att P"). La información disponible sugiere que los requisitos considerables de la secuencia de ADN permiten que la integrasa reconozca menos sitios que los sistemas de integración retrovirales o incluso basados en transposasas, abriendo su carrera como un vehículo portador superior para el transporte e inserción en una serie de sitios genómicos bien establecidos, algunos de los cuales con tan llamadas propiedades de "puerto seguro". [10]
Aprovechando el hecho de rutas de recombinación específicas ( att P x att B), RMCE se hace posible sin requisitos para sitios att heteroespecíficos sintéticos. Esta ventaja obvia, sin embargo, se produce a expensas de ciertas deficiencias, como la falta de control sobre el tipo o la direccionalidad del casete de entrada (donante). [6] Se imponen restricciones adicionales por el hecho de que la irreversibilidad no permite configuraciones estándar de multiplexación-RMCE que incluyen reacciones "RMCE en serie", es decir, intercambios repetidos de casetes en un locus genómico dado .
Outlook y perspectivas
La anotación de los genomas humanos y de ratón ha llevado a la identificación de más de 20 000 genes que codifican proteínas y más de 3 000 genes de ARN no codificantes, que guían el desarrollo del organismo desde la fertilización hasta la embriogénesis y la vida adulta. Aunque se observa un progreso espectacular, la relevancia de las variantes genéticas raras sigue siendo un tema central de investigación.
Como una de las plataformas más importantes para tratar las funciones de genes de vertebrados a gran escala, se han establecido recursos genéticos de células ES murinas mutantes en todo el genoma. Con este fin, se han fundado cuatro programas internacionales destinados a la mutagénesis por saturación del genoma del ratón en Europa y América del Norte (EUCOMM, KOMP, NorCOMM y TIGM). Coordinados por el International Knockout Mouse Consortium (IKSC), estos repositorios de células ES están disponibles para el intercambio entre unidades de investigación internacionales. Los recursos actuales comprenden mutaciones en 11 539 genes únicos, 4 414 de estos condicional. [14]
Las tecnologías relevantes han alcanzado ahora un nivel que permite su extensión a otras especies de mamíferos y a las células madre humanas, sobre todo aquellas con un estado de iPS (pluripotente inducido) .
Ver también
- Recombinación específica del sitio
- Intercambio de casetes mediado por recombinasa
- Cre recombinasa
- Recombinación Cre-Lox
- Recombinación FLP-FRT
- Recombinación genética
- Recombinación homóloga
Referencias
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enlaces externos
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