Puntos cuánticos funcionalizados con ADN

La funcionalización de ADN de puntos cuánticos es la unión de hebras de ADN a la superficie de un punto cuántico. Aunque los puntos cuánticos con Cd tienen cierta liberación citotóxica, los investigadores han funcionalizado los puntos cuánticos para su biocompatibilidad y los han unido al ADN para combinar las ventajas de ambos materiales. Los puntos cuánticos se utilizan comúnmente para obtener imágenes de sistemas biológicos in vitro e in vivo en estudios con animales debido a sus excelentes propiedades ópticas cuando se excitan con la luz, mientras que el ADN tiene numerosas aplicaciones de bioingeniería, que incluyen: ingeniería genética, nanoestructuras de autoensamblaje, unión a proteínas y biomarcadores.. La capacidad de visualizar los procesos químicos y biológicos del ADN permite la retroalimentación para optimizar y aprender sobre estos comportamientos a pequeña escala. ^{[1] [2]}

Figura 1: Soluciones de puntos cuánticos que emiten luz amarillo-naranja y azul claro, excitadas por luz ultravioleta (fabricadas en California Polytechnic San Luis Obispo)

Fondo

Los puntos cuánticos son semiconductores de nanocristales inorgánicos que se comportan excepcionalmente bien como fluoróforos . En el campo de la biología, los fluoróforos son una de las pocas herramientas que nos permiten mirar dentro de un sistema biológico vivo a nivel celular. Como fluoróforo, el tamaño de un punto cuántico refleja directamente la longitud de onda de la luz emitida, lo que permite un espectro de color altamente sintonizable. Dado que el tamaño de los puntos cuánticos es controlable y un tamaño mayor produce un rango de emisión de longitud de onda mayor, los investigadores pueden pintar imágenes en los niveles celular y subcelular con esta tecnología. El problema actual con los puntos cuánticos comunes de CdSe-ZnS es que el Cd es tóxico para las células ^[3]

Figura 2: Máscara de gas utilizada en sala limpia

Para prevenir este problema, las investigaciones están desarrollando formas de modificar las superficies de puntos cuánticos para la biocompatibilidad, además del desarrollo de puntos cuánticos libres de Cd ("CFQD"). Después de que se haya realizado una modificación de la superficie para limitar la toxicidad, la partícula se puede recubrir adicionalmente con una capa de hidrogel o bioconjugado para unirse selectivamente al ADN, que luego se puede usar para la detección de nivel celular o molecular. ^[2]

Figura 3: Esquema de un punto cuántico recubierto con una proteína orgánica unida al ADN

Métodos de modificación de superficies

Encapsulación de hidrogel de puntos cuánticos

Para recubrir los iones de cadmio tóxicos del núcleo de CdSe, se pueden usar capas de hidrogel para recubrir puntos cuánticos para su biocompatibilidad. El propósito de la capa exterior de ZnS en este caso es interactuar con enlaces colgantes , además de mantener la fuerza fluorescente de un fluoróforo de punto cuántico funcional. Dentro de una encapsulación de hidrogel , la superficie de la cáscara de ZnSe puede cargarse para unirse al interior hidrófobo de una micela, lo que luego permite que el exterior hidrófilo permanezca en contacto con una solución acuosa (es decir, el cuerpo humano y la mayoría de los otros sistemas biológicos). La capa de hidrogel funciona como un enlace intermedio simplificado para el ADN u otros materiales orgánicos.

Bioconjugación de puntos cuánticos

Otro tipo de modificación de la superficie es la bioconjugación. Este método utiliza dos biomoléculas que se unen covalentemente entre sí para formar una capa protectora alrededor del punto cuántico. La bioconjugación hidrófoba inhibe la degradación de la estructura del punto cuántico por fuentes dentro del cuerpo que pueden causar degradación. Los bioconjugados se pueden personalizar aún más uniendo ligandos de afinidad a la superficie de la estructura. Estos ligandos permiten que el punto cuántico se una a varios antígenos y se pueden usar para apuntar específicamente a ciertas células. Este es el mecanismo impulsor de la focalización del tumor.

Los puntos cuánticos Core-shell CdSe-ZnS se pueden proteger mediante bioconjugación, utilizando un ligando coordinador y un polímero anfifílico. Un estudio utilizó óxido de tri-n-octilfosfina (TOPO) como ligando y una estructura de polímero tribloque que consta de dos segmentos hidrófobos y un segmento hidrófilo, todos con cadenas laterales de hidrocarburos hidrófobos. Las fuertes interacciones hidrófobas entre el TOPO y el hidrocarburo polimérico permiten que las dos capas se "unan" entre sí, formando una estructura de protección hidrófoba. Esta estructura resiste la degradación por hidrólisis y enzimas, que son métodos habituales de degradación in vivo . Esta capa de bioconjugación protege las propiedades ópticas del punto cuántico en un amplio rango de pH (1-14), condiciones salinas (0.01-1.0M) e incluso después del tratamiento con ácido clorhídrico 1.0M.^[4]

Aditamentos de carboxilo

Figura 4: Punto cuántico recubierto con óxido de zinc, grupos carboxilo y oligonucleótidos para permitir la unión del ADN.

Los grupos carboxilo se pueden inmovilizar en la superficie de un punto cuántico recubierto de óxido de zinc. Las cadenas simples de ADN se pueden modificar con un grupo amino añadido para unirse covalentemente al grupo carboxilo, debido a un enlace amida formado entre los grupos carboxilo y amino en presencia de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropilo). -carbodiimida (EDC). ^[5]Los factores que pueden influir en la unión del ADN monocatenario al grupo carboxilo son el pH y la fuerza iónica. El pH determina cuántos protones están disponibles para formar enlaces covalentes, y hay menos presentes a medida que aumenta el pH. Esto da como resultado menos hebras de ADN que se unen a cada punto cuántico. Una fuerza iónica más baja da como resultado puntos cuánticos más estables, pero también hace que las hebras de ADN se repelan entre sí. Las condiciones óptimas de acoplamiento para más de 10 cadenas de ADN por punto cuántico están a un pH de 7 y una fuerza iónica de 0M. ^[6] Un pH neutro de 7 permite suficientes protones del grupo carboxilo para facilitar la unión covalente del ADN modificado con amino, pero no suficientes protones para desestabilizar los coloides.

Fuerzas intermoleculares

La adición de ADN a la superficie de un punto cuántico cambia las fuerzas intermoleculares que ocurren entre los puntos cuánticos no conjugados. Cambiar las fuerzas intermoleculares entre los puntos cuánticos puede alterar muchas características importantes para el uso de puntos cuánticos en condiciones acuosas. Como la superficie de los puntos cuánticos se conjuga con el ADN, la estabilidad coloidal y la solubilidad se ven afectadas.

Estabilidad coloidal

Los puntos cuánticos conjugados con ADN están sujetos a repulsión electrostática y a las fuerzas de Van der Waals que afectan la estabilidad coloidal de los conjugados de puntos cuánticos-ADN. Unir ADN a la superficie de un punto cuántico aumenta la estabilidad de los puntos cuánticos. Las cadenas de ADN proporcionan más repulsión electrostática que la superficie de los puntos cuánticos, lo que evita que se agreguen y se desprendan de la solución. La estabilidad coloidal se estima a partir de la energía de interacción total entre dos partículas que se calcula mediante la ecuación DLVO ^[7]

${\displaystyle \ V_{t}=V_{vdW}+V_{es}}$

V _es las fuerzas de repulsión electrostática entre dos partículas esféricas idénticas de la doble capa eléctrica de cada partícula. Se calcula con la ecuación ^[6]

${\displaystyle \ V_{es}=2\pi \epsilon _{0}\epsilon R_{P}\psi ^{2}ln[1+exp(\kappa h)]}$

Dónde:

• ${\displaystyle h}$ es la separación entre dos partículas
• ${\displaystyle R_{P}}$ es el radio de las partículas
• ${\displaystyle \epsilon \epsilon _{0}}$es la permitividad del agua
• ${\displaystyle \psi }$ es el potencial de superficie
• ${\displaystyle \kappa }$es la longitud de Debye inversa

V _vdW es la fuerza de atracción entre todas las partículas. Las fuerzas de Van der Waals se calculan con la ecuación ^[6]

${\displaystyle \ V_{vdW}={A_{H} \over 6}[ln{h(4R_{P}+h) \over (2R_{P}+h)^{2}}+{(2R_{P}^{2}) \over h(4R_{P}+h)}+{(2R_{P}^{2}) \over (2R_{P}+h)^{2}}]}$

Dónde

• ${\displaystyle A_{H}}$es la constante efectiva de Hamaker

La estabilidad coloidal de los puntos cuánticos puede diferir con los cambios de pH y fuerza iónica. En general, la conjugación de ADN aumenta la estabilidad de los puntos cuánticos al proporcionar repulsión electrostática y estérica, lo que evita que las partículas se agreguen debido a las fuerzas de van der Waals. ^[6]

Solubilidad

Para utilizar puntos cuánticos en muchas aplicaciones relacionadas con la biología, los puntos cuánticos deben ser solubles en entornos acuosos. Para que los puntos cuánticos se solubilicen en agua, los ligandos anfifílicos deben estar en la superficie de los puntos cuánticos. El ADN se puede utilizar como ligando de solubilización debido a su naturaleza anfifílica. ^[1] Esto permite que los puntos cuánticos funcionalizados con ADN se utilicen en las condiciones acuosas que a menudo se encuentran en la biología y la investigación médica. La mayor solubilidad es necesaria para permitir que los puntos cuánticos se utilicen como una sonda de formación de imágenes de ADN en un sistema biológico.

Aplicaciones

Los puntos cuánticos se han convertido en poderosas herramientas de obtención de imágenes y evolucionan continuamente hacia la biocompatibilidad con la esperanza de obtener imágenes con éxito de humanos y otros sistemas biológicos vivos. Al reducir la cantidad de Cd liberado alrededor de las células, los investigadores se han esforzado por crear métodos de prueba in vitro e in vivo para obtener imágenes de estructuras a nano y microescala. La alta resolución dentro del rango nanométrico demuestra la utilidad de obtener imágenes del comportamiento del ADN tanto para la retroalimentación de bioingeniería como para la observación y el análisis biológicos y químicos. La capacidad de controlar los espectros de emisión alterando el tamaño de los puntos cuánticos permite a los investigadores codificar muchos objetivos diferentes por color. ^[8]

Tamaño (nm)	Pico de emisión (nm)	Color
2.2 [9]	495	azul
2.9 [9]	550	verde
3.1 [10]	576	amarillo
4.1 [9]	595	naranja
4.4 [11]	611	naranja
4.8 [10]	644	rojo
7.3 [9]	655	rojo oscuro

Cuantificar y obtener imágenes de la expresión génica

Dado que los puntos cuánticos tienen una alta fotoestabilidad y luminiscencia, los investigadores los están utilizando para iluminar el ARNm dentro de las células para obtener imágenes de la expresión génica. Las sondas de oligonucleótidos modificadas con amina unidas a grupos carboxilo en puntos cuánticos muestran hibridación específica de secuencia. Estas sondas también pueden detectar genes de baja expresión. ^[12] Esto potencialmente permite a los investigadores comprender cuándo y dónde se producen ciertas proteínas.

Nanoestructuras autoensamblables

Los puntos cuánticos autoensamblados se forman espontáneamente en condiciones específicas durante la epitaxia del haz molecular u otra forma de deposición atómica. Esta formación espontánea es una consecuencia del desajuste de la red entre el material semiconductor depositado y el sustrato subyacente. La estructura resultante formada en la superficie del sustrato es una nanoestructura de "isla" tridimensional. Las islas se forman en puntos cuánticos cubriéndolos con otro material semiconductor, en un proceso llamado confinamiento cuántico. ^{[13] [14]} Los puntos cuánticos autoensamblados brindan oportunidades en aplicaciones tecnológicas como la criptografía cuántica, la computación cuántica, la óptica y la optoelectrónica. ^[13]

Imágenes de una sola molécula

En el pasado, se usaba proteína verde fluorescente (GFP) para rastrear el movimiento dentro de las células. Sin embargo, GFP no se ilumina bien y es inestable después de la aplicación. Por lo tanto, la GFP impidió los estudios a largo plazo del movimiento de proteínas. Mediante el uso de puntos cuánticos, que son más estables, los investigadores ahora pueden rastrear proteínas a través de células que atraviesan diferentes vías. ^[15] Con el fin de superar la incapacidad de las cámaras para capturar la profundidad, los investigadores han desarrollado un aparato de seguimiento 3D que puede trazar con precisión el camino de las proteínas dentro de las células. ^[dieciséis]

Seguimiento de proteínas en tiempo real

Debido a que los puntos cuánticos tienen espectros de longitud de onda ajustados junto con altas intensidades de emisión y tamaño pequeño, los puntos cuánticos se han convertido en la norma para el seguimiento de moléculas. Sin embargo, los puntos cuánticos tienen dos niveles: brillante y oscuro. Para cantidades bajas, esto es un problema, ya que los investigadores necesitan rastrear dónde fue la molécula durante la etapa de oscuridad, que puede variar desde varios milisegundos hasta horas. El fenómeno de parpadeo no es un problema cuando se toman imágenes de objetos más grandes (es decir, tumores), ya que habrá suficientes puntos cuánticos en el estado brillante para obtener la imagen, incluso cuando varios pueden permanecer en su etapa oscura. ^[17]

Ver también

• ADN
• Puntos cuánticos
• Hidrogel
• Encapsulación de hidrogel de puntos cuánticos
• Biocompatibilidad

Referencias

1. X. Michalet; FF Pinaud; LA Bentolila; et al. (2005). "Puntos cuánticos para células vivas, imágenes en vivo y diagnóstico" . Ciencia . 307 (5709): 538–544. Código bibliográfico : 2005Sci ... 307..538M . doi : 10.1126 / science.1104274 . PMC  1201471 . PMID  15681376 .
2. Catherine J. Murphy; Eric B. Brauns; Latha Gearheart (1996). "Puntos cuánticos como proteínas de unión al ADN inorgánico". Procedimientos de MRS . 452 : 452–597. doi : 10.1557 / PROC-452-597 .
3. Santos, Ana R .; Miguel, Ana S .; Macovei, Anca. (2013). "CdSe / ZnS Quantum Dots desencadenan la reparación del ADN y los sistemas de enzimas antioxidantes en células de Medicago sativa en cultivo en suspensión" . Biotecnología BMC . 13 : 111. doi : 10.1186 / 1472-6750-13-111 . PMC 3901376 . PMID 24359290 .  
4. Gao, Xiaohu (2004). "In Vivo Cancer Targeting and Imaging with Semiconductor Quantum Dots". Biotecnología de la naturaleza . 22 (8): 969–976. doi : 10.1038 / nbt994 . PMID 15258594 . 
5. Pong, Boon Kin; Trucha, Bernhardt L .; Lee, Jim Yang (2007). "Preparación de puntos cuánticos de CdSe / ZnS funcionalizados con ADN". Ingeniería Química y Farmacéutica . 1 .
6. Dazhi Sun; Oleg Gang (2013). "Puntos cuánticos funcionalizados por ADN: fabricación, propiedades estructurales y fisicoquímicas". Langmuir . 29 (23): 7038 hasta 7.046. doi : 10.1021 / la4000186 . PMID 23706124 . 
7. Russel, WB (1989). Dispersiones coloidales . Prensa de la Universidad de Cambridge. ISBN 9780511608810.
8. Mingyong Han; Xiaohu Gao; Jack Z. Su (2001). "Microperlas marcadas con puntos cuánticos para la codificación óptica multiplexada de biomoléculas". Biotecnología de la naturaleza . 19 (7): 631–635. doi : 10.1038 / 90228 . PMID 11433273 . 
9. Andrew M. Smith; Hongwei Duan; Aaron M. Mohs (2008). "Puntos cuánticos bioconjugados para imágenes celulares y moleculares in vivo" . Entrega de medicamentos . 60 (11): 1226-1240. doi : 10.1016 / j.addr.2008.03.015 . PMC 2649798 . PMID 18495291 .  
10. Daniele Gerion; Fabien Pinaud; Shara C. Williams (2001). "Síntesis y propiedades de puntos cuánticos de semiconductores de CdSe / ZnS recubiertos de sílice biocompatible soluble en agua" . J. Phys. Chem. B . 105 (37): 8861–8871. doi : 10.1021 / jp0105488 .
11. Warren CW Chan; Dustin J Maxwell; Xiaohu Gao (2002). "Puntos cuánticos luminiscentes para detección e imágenes biológicas multiplexadas". Opinión Actual en Biotecnología . 13 (1): 40–46. doi : 10.1016 / S0958-1669 (02) 00282-3 . PMID 11849956 . 
12. Choi, Youngseon; Kim, Hwa Pyung; Hong, Suk Min; Ryu, Ji Young; Han, Sung Jun; Song, Rita (18 de septiembre de 2009). "Visualización in situ de la expresión génica utilizando conjugados de ADN-punto-cuántico recubiertos de polímero". Pequeño . 5 (18): 2085-2091. doi : 10.1002 / smll.200900116 . PMID 19517489 . 
13. Ryman-Rasmussen, Jessica P; Riviere, Jim E; Monteiro-Riviere, Nancy A (10 de agosto de 2006). "Los recubrimientos superficiales determinan la citotoxicidad y el potencial de irritación de nanopartículas de puntos cuánticos en queratinocitos epidérmicos" . Revista de Dermatología Investigativa . 127 (1): 143-153. doi : 10.1038 / sj.jid.5700508 . PMID 16902417 . 
14. Petroff, Pierre M .; Lorke, Axel; Imamoglu, Atac (mayo de 2001). "Puntos cuánticos autoensamblados epitaxialmente" (5). Scitation. doi : 10.1063 / 1.1381102 .
15. Baba, Koichi; Nishida, Kohji (2012). "Seguimiento de una sola molécula en células vivas mediante aplicaciones de punto cuántico único" . Teranósticos . 2 (7): 655–667. doi : 10.7150 / thno.3890 . PMC 3418928 . PMID 22896768 .  
16. Wells, Nathan P .; Lessard, Guillaume A .; Goodwin, Peter M .; Phipps, Mary E .; Cutler, Patrick J .; Lidke, Diane S .; Wilson, Bridget S .; Werner, James H. (10 de noviembre de 2010). "Seguimiento molecular tridimensional resuelto en el tiempo en células vivas" . Nano Letras . 10 (11): 4732–4737. Código Bib : 2010NanoL..10.4732W . doi : 10.1021 / nl103247v . PMC 3061257 . PMID 20957984 .  
17. Pinaud, Fabien; Clarke, Samuel; Sittner, Assa; Dahan, Maxime (30 de marzo de 2010). "Sondeo de eventos celulares, un punto cuántico a la vez". Métodos de la naturaleza . 7 (4): 275-285. doi : 10.1038 / NMETH.1444 . PMID 20354518 .