RecBCD ( EC 3.1.11.5 , exonucleasa V , Escherichia coli exonucleasa V , E. coli exonucleasa V , gen recBC endoenzyme , RecBC deoxyribonuclease , gen recBC DNasa , gen RecBCD enzimas ) es una enzima de la E. coli bacteria que iniciados recombinational reparación de roturas de doble hebra potencialmente letales en el ADN que pueden resultar de radiación ionizante , errores de replicación, endonucleasas , daño oxidativo y una serie de otros factores.[2] [3] La enzima RecBCD es a la vez una helicasa que desenrolla o separa las hebras de ADN y una nucleasa que produce muescas de una sola hebra en el ADN. [1]
Exodesoxirribonucleasa V | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 3.1.11.5 | |||||||
No CAS. | 37350-26-8 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
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Estructura
El complejo enzimático se compone de tres subunidades diferentes llamadas RecB, RecC y RecD y, por lo tanto, el complejo se denomina RecBCD (Figura 1). Antes del descubrimiento del gen recD , [4] la enzima se conocía como "RecBC". Cada subunidad está codificada por un gen separado:
gene | cadena | proteína | función |
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RecB | beta | P08394 | 3'-5 'helicasa, nucleasa |
RecC | gama | P07648 | Reconoce Chi ( c rossover h otspot i nstigator) |
Recibido | alfa | P04993 | 5'-3 'helicasa |
Función
Tanto las subunidades RecD como RecB son helicasas, es decir , motores moleculares dependientes de la energía que desenrollan el ADN (o ARN en el caso de otras proteínas). La subunidad RecB además tiene una función nucleasa. [5] Finalmente, la enzima RecBCD (quizás la subunidad RecC) reconoce una secuencia específica en el ADN, 5 ' -GCTGGTGG- 3' , conocida como Chi (a veces designada con la letra griega χ).
RecBCD es inusual entre las helicasas porque tiene dos helicasas que viajan con diferentes velocidades [6] y porque puede reconocer y ser alterada por la secuencia de ADN Chi. [7] [8] RecBCD se une con avidez a un extremo de ADN lineal bicatenario (ds). La helicasa RecD viaja en la hebra con un extremo 5 'en el que la enzima inicia el desenrollamiento, y RecB en la hebra con un extremo 3'. RecB es más lento que RecD, por lo que un bucle de ADN monocatenario (ss) se acumula antes que RecB (Figura 2). Esto produce estructuras de ADN con dos colas ss (una cola de extremo 3 'más corta y una cola de extremo 5' más larga) y un bucle ss (en la hebra de extremo 3 ') observado por microscopía electrónica. [9] Las colas ss se pueden templar para producir un segundo bucle ss complementario al primero; Inicialmente, estas estructuras de doble bucle se denominaron "orejas de conejo".
Mecanismo de acción
Durante el desenrollado, la nucleasa en RecB puede actuar de diferentes formas dependiendo de las condiciones de reacción, en particular la relación de las concentraciones de iones Mg 2+ y ATP. (1) Si el ATP está en exceso, la enzima simplemente corta la hebra con Chi (la hebra con el extremo 3 'inicial) (Figura 2). [10] [11] El desenrollado continúa y produce una cola de 3 con Chi cerca de su término. Esta cola puede unirse a la proteína RecA, que promueve el intercambio de hebras con un dúplex de ADN homólogo intacto. [12] Cuando RecBCD llega al final del ADN, las tres subunidades se desmontan y la enzima permanece inactiva durante una hora o más; [13] una molécula de RecBCD que actuó en Chi no ataca a otra molécula de ADN. (2) Si los iones Mg 2+ están en exceso, RecBCD escinde endonucleolíticamente ambas cadenas de ADN, aunque la cola 5 'se escinde con menos frecuencia (Figura 3). [14] Cuando RecBCD encuentra un sitio Chi en la hebra del extremo 3 ', se reducen las pausas de desenrollado y la digestión de la cola 3'. [15] Cuando RecBCD vuelve a desenrollarse, ahora escinde la hebra opuesta ( es decir , la cola 5 ') [16] [17] y carga la proteína RecA en la hebra del extremo 3'. [12] Después de completar la reacción en una molécula de ADN, la enzima ataca rápidamente un segundo ADN, en el que ocurren las mismas reacciones que en el primer ADN.
Aunque ninguna reacción ha sido verificada por análisis de ADN intracelular, debido a la naturaleza transitoria de los intermediarios de reacción, la evidencia genética indica que la primera reacción se asemeja más a la de las células. [2] Por ejemplo, la actividad de Chi está influenciada por nucleótidos en su lado 3 ', tanto en células como en reacciones con ATP en exceso pero no con Mg 2+ en exceso [PMIDs 27401752, 27330137]. Los mutantes de RecBCD que carecen de actividad de exonucleasa detectable retienen una alta actividad de hotspot de Chi en las células y muescas en Chi fuera de las células. [18] Un sitio Chi en una molécula de ADN en las células reduce o elimina la actividad Chi en otro ADN, tal vez reflejando el desmontaje de RecBCD dependiente de Chi observado in vitro en condiciones de exceso de ATP y corte de ADN en Chi. [19] [20]
En ambas condiciones de reacción, la hebra 3 'permanece intacta corriente abajo de Chi. A continuación, RecBCD carga activamente la proteína RecA en la cola 3 '. [12] En algún punto indeterminado, RecBCD se disocia del ADN, aunque RecBCD puede desenrollar al menos 60 kb de ADN sin caerse. RecA inicia el intercambio de la hebra de ADN a la que está unida con la hebra idéntica, o casi idéntica, en un dúplex de ADN intacto; este intercambio de hebras genera una molécula de ADN conjunta, como un bucle D (Figura 2). Se cree que la molécula de ADN conjunta se resuelve por replicación cebada por la cadena invasora del extremo 3 'que contiene Chi o por escisión del bucle D y formación de una unión de Holliday. La unión de Holliday puede resolverse en ADN lineal mediante el complejo RuvABC o disociarse mediante la proteína RecG . Cada uno de estos eventos puede generar ADN intacto con nuevas combinaciones de marcadores genéticos por los cuales los ADN de los padres pueden diferir. Este proceso, recombinación homóloga , completa la reparación de la rotura del ADN bicatenario.
Aplicaciones
RecBCD es una enzima modelo para el uso de fluorescencia de una sola molécula como técnica experimental utilizada para comprender mejor la función de las interacciones proteína-ADN. [21] La enzima también es útil para eliminar ADN lineal, ya sea monocatenario o bicatenario, de preparaciones de ADN circular bicatenario, ya que requiere un extremo de ADN para su actividad.
Referencias
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enlaces externos
- Exodesoxirribonucleasa + V en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Exodesoxirribonucleasa + V, + E + coli en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- EC 3.1.11.5