La pérdida de fluorescencia en el fotoblanqueo (FLIP) es una técnica de microscopía de fluorescencia utilizada para examinar el movimiento de moléculas dentro de células y membranas. Por lo general, una membrana celular se marca con un tinte fluorescente para permitir la observación. Luego, un área específica de esta sección etiquetada se blanquea varias veces utilizando el rayo de un microscopio de escaneo láser confocal . Después de cada exploración imaginaria, se vuelve a blanquear. Esto ocurre varias veces, para asegurar que todos los fluoróforos accesiblesse blanquean porque los fluoróforos sin blanquear se intercambian por fluoróforos blanqueados, lo que provoca el movimiento a través de la membrana celular. A continuación, se mide la cantidad de fluorescencia de esa región durante un período de tiempo para determinar los resultados del fotoblanqueo en la célula en su conjunto.
Configuración experimental
Antes de que pueda producirse el fotoblanqueo, las células deben inyectarse con una proteína fluorescente, a menudo una proteína verde fluorescente (GFP) , que permitirá que las proteínas objetivo emitan fluorescencia y, por lo tanto, se siga durante todo el proceso. Luego, se debe definir una región de interés. Esta región inicial de interés generalmente contiene la célula completa o varias células. En FLIP, el fotoblanqueo ocurre justo fuera de la región de interés; por lo tanto, también es necesario definir una región de fotoblanqueo. También es necesario determinar una tercera región, la región donde se llevará a cabo la medición. Es necesario realizar una serie de exploraciones iniciales para determinar la fluorescencia antes del fotoblanqueo. Estos escaneos servirán como escaneos de control, con los que se compararán los escaneos fotoblanqueados más adelante. Entonces puede ocurrir fotoblanqueo. Entre cada pulso de blanqueador, es necesario dejar tiempo para la recuperación del material fluorescente. También es importante tomar varias exploraciones de la región de interés inmediatamente después de cada pulso de blanqueador para un estudio adicional. [1] El cambio de fluorescencia en la región de interés se puede cuantificar de una de estas tres formas. Lo más común es elegir la ubicación, el tamaño y el número de las regiones de interés basándose en la inspección visual de los conjuntos de imágenes. Los otros dos enfoques, bastante nuevos pero más fiables, son mediante la detección de áreas de diferente movilidad de la sonda sobre una base de imagen individual o mediante el modelado físico de la pérdida de fluorescencia de los cuerpos en movimiento. [2]
La pérdida de fluorescencia se define por la fracción móvil, o la fracción de fluoróforos capaz de recuperarse en un área fotoblanqueada, de la proteína marcada con fluorescencia. La pérdida incompleta de fluorescencia indica que hay fluoróforos que no se mueven ni viajan al área decolorada. Esto permite definir la fracción inmóvil, o la fracción de fluoróforos incapaces de recuperarse en un área fotoblanqueada, de proteínas marcadas con fluorescencia. La inmovilidad indica que hay proteínas que pueden estar en compartimentos cerrados al resto de la célula, evitando que se vean afectadas por el fotoblanqueo repetido. [3]
Aplicaciones
Verificación de la continuidad de los orgánulos membranosos
El uso principal de FLIP es determinar la continuidad de los orgánulos membranosos. Esta continuidad o falta de ella se determina observando la cantidad de fluorescencia en la región de interés. Si hay una pérdida completa de fluorescencia, esto indica que los orgánulos son continuos. Sin embargo, si hay una pérdida incompleta de fluorescencia, entonces no hay continuidad entre los orgánulos. En cambio, estos orgánulos están compartimentados y, por lo tanto, cerrados a la transferencia de cualquier fluoróforo fotoblanqueado. [3] Se ha verificado la continuidad del aparato de Golgi, el retículo endoplásmico y el núcleo mediante FLIP.
Tipo de cambio entre el núcleo y el citoplasma
Dos de los otros usos de FLIP que se emplean con menos frecuencia son determinar cómo se transportan las proteínas desde el citoplasma al núcleo y luego determinar la velocidad a la que se produce este transporte. Para determinar qué partes están involucradas y cuándo están involucradas en el proceso de transporte, se observan exploraciones continuas. Cuanto antes se utilice una parte del citoplasma en el proceso de transporte, más rápidamente experimentará la pérdida completa de fluorescencia. [4] La imagen resultante de este proceso debería ser un citoplasma completamente fotoblanqueado. Si la célula también participa en la exportación nuclear desde el núcleo al citoplasma, también se producirá un fotoblanqueo en el núcleo.
El tipo de cambio entre el núcleo y el citoplasma también se puede determinar a partir de este tipo de datos. En estos casos, la región de fotoblanqueo está dentro del núcleo. Si el transporte se produce a un ritmo rápido, los niveles de fluorescencia dentro de los compartimentos nucleares disminuirán rápidamente a través de los fotogramas tomados. Sin embargo, si el transporte se produce lentamente, los niveles de fluorescencia no se verán afectados o disminuirán solo ligeramente. [4]
FLIP frente a FRAP
FLIP se usa a menudo y está estrechamente asociado con la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). La principal diferencia entre estas dos técnicas de microscopía es que FRAP implica el estudio de la capacidad de una célula para recuperarse después de un único evento de fotoblanqueo, mientras que FLIP implica el estudio de cómo la pérdida de fluorescencia se propaga por toda la célula después de múltiples eventos de fotoblanqueo. Esta diferencia de propósito también conduce a una diferencia en las partes de la célula que se observan. En FRAP, el área que realmente se fotoblanquea es el área de interés. Por el contrario, en FLIP, la región de interés se encuentra fuera de la región que se está fotoblanqueando. Otra diferencia importante es que en FRAP, hay un solo evento de fotoblanqueo y un período de recuperación para observar qué tan bien los fluoróforos regresan al sitio blanqueado. Sin embargo, en FLIP, ocurren múltiples eventos de fotoblanqueo para prevenir el regreso de fluoróforos sin blanquear a la región de blanqueo. Al igual que FLIP, FRAP se utiliza en el estudio de la continuidad de orgánulos membranosos. FLIP y FRAP a menudo se usan juntos para determinar la movilidad de proteínas etiquetadas con GFP. [3] FLIP también se puede utilizar para medir la transferencia molecular entre regiones de una célula independientemente de la velocidad de movimiento. Esto permite un análisis más completo del tráfico de proteínas dentro de una célula. Esto difiere de FRAP que es principalmente útil para determinar la movilidad de proteínas en regiones locales al fotoblanqueo solamente. [5]
Posibles complicaciones
Hay varias complicaciones relacionadas con FLIP y FRAP. Dado que ambas formas de microscopía examinan las células vivas, siempre existe la posibilidad de que las células se muevan y provoquen resultados falsos. La mejor manera de evitar esto es utilizar un algoritmo de alineación, que compensará cualquier movimiento y eliminará una gran parte del error debido al movimiento. En estos experimentos, también es clave tener un grupo de control para ajustar los resultados y corregir la curva de recuperación para la pérdida total de fluorescencia. [3] Otra forma de minimizar el error es mantener el fotoblanqueo contenido en una sola región o área. Esta limitación servirá como control y limitará la pérdida de fluorescencia debida al fotodaño en comparación con la pérdida de fluorescencia debida al fotoblanqueo. [3]
Ver también
Referencias
- ^ Robert C. Dickson; Michael Dean Mendenhall (2004). Protocolos de transducción de señales (2 ed.). Springer Science & Business Media . págs. 300-304. ISBN 978-1-59259-816-8.
- ^ Wüstner, Daniel; Lukasz M Solanko; Frederik W Lund; Daniel Sage; Hans J Schroll; Michael A Lomholt (13 de noviembre de 2012). "Pérdida cuantitativa de fluorescencia en fotoblanqueo para análisis de transporte y agregación de proteínas" . BMC Bioinformática . 13 : 296. doi : 10.1186 / 1471-2105-13-296 . PMC 3557157 . PMID 23148417 .
- ^ a b c d e Ishikawa-Ankerhold, Hellen C .; Ankerhold, Richard; Bateristas, Gregor PC (2012). "Técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia: FRAP, FLIP, FLAP, FRET y FLIM" . Moléculas . 17 (4): 4047–4132. doi : 10,3390 / moléculas17044047 . PMC 6268795 . PMID 22469598 .
- ^ a b Davies, RG; DA Jans; KM Wagstaff (2010). "Uso de técnicas de fotoblanqueo por fluorescencia para medir la cinética del transporte intracelular" (PDF) . Microscopía: ciencia, tecnología, aplicaciones y educación . Archivado desde el original (PDF) el 26 de diciembre de 2014 . Consultado el 25 de noviembre de 2012 .
- ^ Kitamura, Akira; Kubota, Hiroshi (diciembre de 2010). "Oligómeros amiloides: dinámica y toxicidad en el citosol y núcleo" . Diario FEBS . 277 (6): 1369-1379. doi : 10.1111 / j.1742-4658.2010.07570.x . PMID 20148962 .