La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) es un método para determinar la cinética de difusión a través de tejidos o células. Es capaz de cuantificar la difusión lateral bidimensional de una película molecularmente delgada que contiene sondas marcadas con fluorescencia o de examinar células individuales. Esta técnica es muy útil en estudios biológicos de difusión de la membrana celular y unión a proteínas. Además, la deposición superficial de una bicapa (o monocapa) de fosfolípidos fluorescentes permite la caracterización de superficies hidrófilas (o hidrófobas ) en términos de estructura superficial y energía libre.
Se han desarrollado técnicas similares, aunque menos conocidas, para investigar la difusión y unión tridimensional de moléculas dentro de la célula; también se les conoce como FRAP.
Configuración experimental
El aparato básico comprende un microscopio óptico , una fuente de luz y una sonda fluorescente . La emisión fluorescente depende de la absorción de una longitud de onda óptica o de un color específico que restringe la elección de las lámparas. Por lo general, se utiliza una fuente de xenón o mercurio de amplio espectro junto con un filtro de color. La técnica comienza guardando una imagen de fondo de la muestra antes del fotoblanqueo. A continuación, la fuente de luz se enfoca en un pequeño parche del área visible, ya sea cambiando a un objetivo de microscopio de mayor aumento o con luz láser de la longitud de onda apropiada. Los fluoróforos en esta región reciben iluminación de alta intensidad que hace que su vida de la fluorescencia de forma rápida transcurrido (limitado a aproximadamente 10 5 fotones antes de la extinción). Ahora, la imagen en el microscopio es la de un campo uniformemente fluorescente con una mancha oscura notable. A medida que avanza el movimiento browniano, las sondas aún fluorescentes se difundirán por toda la muestra y reemplazarán las sondas no fluorescentes en la región blanqueada. Esta difusión procede de forma ordenada, determinable analíticamente a partir de la ecuación de difusión . Suponiendo un perfil gaussiano para el haz de blanqueo, la constante de difusión D se puede calcular simplemente a partir de:
donde w es el radio del haz y t D es el tiempo de difusión "Característico". [1] [2]
Aplicaciones
Bicapas lipídicas compatibles
Originalmente, la técnica FRAP estaba destinada a usarse como un medio para caracterizar la movilidad de moléculas de lípidos individuales dentro de una membrana celular. [1] Si bien proporciona una gran utilidad en este papel, la investigación actual se inclina más hacia la investigación de membranas lipídicas artificiales. Con el apoyo de sustratos hidrófilos o hidrófobos (para producir bicapas lipídicas o monocapas respectivamente) e incorporando proteínas de membrana , estas estructuras biomiméticas son potencialmente útiles como dispositivos analíticos para determinar la identidad de sustancias desconocidas, comprender la transducción celular e identificar los sitios de unión de ligandos.
Enlace proteico
Esta técnica se usa comúnmente junto con proteínas de fusión de proteína verde fluorescente (GFP) , donde la proteína estudiada se fusiona con una GFP. Cuando se excita con una longitud de onda de luz específica, la proteína emitirá fluorescencia. [3] Cuando la proteína que se está estudiando se produce con GFP, entonces se puede rastrear la fluorescencia. La fotodestrucción de la GFP y luego observar la repoblación en el área blanqueada puede revelar información sobre los socios de interacción de proteínas, la continuidad de los orgánulos y el tráfico de proteínas. [4]
Si después de algún tiempo la fluorescencia ya no alcanza el nivel inicial, entonces una parte de la fluorescencia es causada por una fracción inmóvil (que no puede reponerse por difusión). De manera similar, si las proteínas fluorescentes se unen a receptores celulares estáticos, la tasa de recuperación se retrasará por un factor relacionado con los coeficientes de asociación y disociación de la unión. Esta observación se ha aprovechado más recientemente para investigar la unión a proteínas. [3] [5] [6] De manera similar, si la proteína marcada con GFP se incorpora constitutivamente en un complejo más grande, la dinámica de la recuperación de la fluorescencia se caracterizará por la difusión del complejo más grande. [7]
Aplicaciones fuera de la membrana
FRAP también se puede usar para monitorear proteínas fuera de la membrana. Después de que la proteína de interés se vuelve fluorescente, generalmente por expresión como proteína de fusión GFP, se usa un microscopio confocal para fotoblanquear y monitorear una región del citoplasma , [3] huso mitótico , núcleo u otra estructura celular. [8] La fluorescencia media en la región se puede representar en función del tiempo desde el fotoblanqueo, y la curva resultante puede producir coeficientes cinéticos, como los de las reacciones de unión de la proteína y / o el coeficiente de difusión de la proteína en el medio en el que se está aplicando. supervisado. [9] A menudo, las únicas dinámicas consideradas son la difusión y las interacciones de unión / desvinculación, sin embargo, en principio, las proteínas también pueden moverse a través del flujo, es decir, experimentar un movimiento dirigido, y esto fue reconocido muy temprano por Axelrod et al. [1] Esto podría deberse al flujo del citoplasma o nucleoplasma, o al transporte a lo largo de filamentos en la célula, como los microtúbulos, por motores moleculares .
El análisis es más simple cuando la recuperación de la fluorescencia está limitada por la velocidad de difusión en el área blanqueada o por la velocidad a la que las proteínas blanqueadas se separan de sus sitios de unión dentro del área blanqueada y son reemplazadas por proteína fluorescente. Echemos un vistazo a estos dos límites, para el caso común de blanquear una proteína de fusión GFP en una célula viva.
Recuperación de fluorescencia limitada por difusión
Para una mancha circular de lejía de radio y recuperación dominada por difusión, la fluorescencia se describe mediante una ecuación derivada de Soumpasis [10] (que implica funciones de Bessel modificadas y )
con la escala de tiempo característica para la difusión, y es la hora. es la fluorescencia normalizada (va a 1 como va al infinito). La escala de tiempo de difusión para una mancha de radio blanqueada es , con D el coeficiente de difusión.
Tenga en cuenta que esto es para un blanqueador instantáneo con un perfil de función escalonada, es decir, la fracción de proteína que se supone que se blanquea instantáneamente en el momento es , y , por es la distancia desde el centro del área blanqueada. También se supone que la recuperación puede modelarse por difusión en dos dimensiones, que también es uniforme e isotrópica. En otras palabras, que la difusión se produce en un medio uniforme, por lo que la constante de difusión efectiva D es la misma en todas partes, y que la difusión es isotrópica, es decir, se produce a la misma velocidad a lo largo de todos los ejes del plano.
En la práctica, en una celda ninguna de estas suposiciones será estrictamente cierta.
- El blanqueamiento no será instantáneo. Particularmente si se requiere un blanqueo fuerte de un área grande, el blanqueamiento puede tardar una fracción significativa del tiempo de difusión.. Entonces, una fracción significativa de la proteína blanqueada se difundirá fuera de la región blanqueada realmente durante el blanqueo. Al no tener en cuenta esta introducirá un error significativo en D . [11] [12] [13]
- El perfil blanqueado no será una función de escalón radial. Si la mancha blanqueada es efectivamente un solo píxel, entonces el blanqueamiento en función de la posición estará típicamente limitado por difracción y determinado por la óptica del microscopio de barrido láser confocal utilizado. Esta no es una función de paso radial y también varía a lo largo del eje perpendicular al plano.
- Por supuesto, las células son tridimensionales, no bidimensionales, como lo es el volumen blanqueado. Descuidar la difusión fuera del plano (consideramos que este es el plano xy ) será una aproximación razonable solo si la fluorescencia se recupera predominantemente a través de la difusión en este plano. Esto será cierto, por ejemplo, si un volumen cilíndrico se blanquea con el eje del cilindro a lo largo del eje zy con este volumen cilíndrico atravesando toda la altura de la celda. Entonces, la difusión a lo largo del eje z no provoca la recuperación de la fluorescencia, ya que todas las proteínas se blanquean uniformemente a lo largo del eje z , por lo que descuidarla, como lo hace la ecuación de Soumpasis, es inofensivo. Sin embargo, si la difusión a lo largo del eje z contribuye a la recuperación de la fluorescencia, debe tenerse en cuenta.
- No hay razón para esperar que el citoplasma o el nucleoplasma celular sean completamente uniformes o isotrópicos en el espacio.
Por lo tanto, la ecuación de Soumpasis es solo una aproximación útil, que se puede usar cuando las suposiciones enumeradas anteriormente son buenas aproximaciones a la situación real, y cuando la recuperación de la fluorescencia está de hecho limitada por la escala de tiempo de difusión. . Tenga en cuenta que el hecho de que Soumpasis pueda adaptarse adecuadamente a los datos no implica necesariamente que los supuestos sean ciertos y que la difusión domine la recuperación.
Recuperación limitada por reacción
La ecuación que describe la fluorescencia en función del tiempo es particularmente simple en otro límite. Si un gran número de proteínas se unen a sitios en un volumen pequeño de modo que allí la señal de fluorescencia está dominada por la señal de las proteínas unidas, y si esta unión está en un solo estado con una tasa de apagado k off , entonces la fluorescencia como un la función del tiempo viene dada por [14]
Tenga en cuenta que la recuperación depende de la constante de velocidad de desvinculación, k off , únicamente. No depende de la tasa de encuadernación. Aunque depende de una serie de supuestos [14]
- La tasa de on debe ser lo suficientemente grande para que la concentración local de proteína unida exceda en gran medida la concentración local de proteína libre y, por lo tanto, nos permita descuidar la contribución af de la proteína libre.
- La reacción es una reacción bimolecular simple, donde la proteína se une a sitios localizados que no se mueven significativamente durante la recuperación.
- El intercambio es mucho más lento que la difusión (o cualquier mecanismo de transporte responsable de la movilidad), ya que solo entonces la fracción de difusión se recupera rápidamente y luego actúa como fuente de proteína fluorescente que se une y reemplaza a la proteína blanqueada unida y así aumenta la fluorescencia. Con r el radio de la mancha blanqueada, esto significa que la ecuación solo es válida si la vida útil limitada.
Si se satisfacen todas estas suposiciones, entonces ajustar una exponencial a la curva de recuperación dará la constante de tasa de apagado, k off . Sin embargo, otras dinámicas pueden dar curvas de recuperación similares a las exponenciales, por lo que ajustar una exponencial no implica necesariamente que la recuperación esté dominada por una simple reacción bimolecular. Una forma de distinguir entre la recuperación con una tasa determinada por la desvinculación y la recuperación limitada por la difusión es observar que la tasa de recuperación para la recuperación limitada por desvinculación es independiente del tamaño del área blanqueada r , mientras que escala como, para recuperación limitada por difusión. Por lo tanto, si se blanquean un área pequeña y una grande, si la recuperación está limitada por la desunión, las tasas de recuperación serán las mismas para los dos tamaños de área blanqueada, mientras que si la recuperación está limitada por la difusión, será mucho más lenta para el blanqueado más grande. área.
Difusión y reacción
En general, la recuperación de la fluorescencia no estará dominada ni por la difusión isotrópica simple ni por una sola velocidad de desvinculación simple. Habrá difusión y unión y, de hecho, la constante de difusión puede no ser uniforme en el espacio, y puede haber más de un tipo de sitios de unión, y estos sitios también pueden tener una distribución no uniforme en el espacio. Los procesos de flujo también pueden ser importantes. Este comportamiento más complejo implica que se requiere un modelo con varios parámetros para describir los datos; los modelos con una única constante de difusión D o una única constante de velocidad de apagado, k off , son inadecuados.
Hay modelos tanto de difusión como de reacción. [2] Desafortunadamente, una sola curva FRAP puede proporcionar evidencia insuficiente para ajustar de manera confiable y única (posiblemente ruidosos) datos experimentales. Sadegh Zadeh y col. [15] han demostrado que las curvas FRAP pueden ser ajustadas por diferentes pares de valores de la constante de difusión y la constante de velocidad, o, en otras palabras, los que se ajustan al FRAP no son únicos. Esto es en ajustes de tres parámetros (constante de velocidad, constante de velocidad fuera y constante de difusión). Los ajustes que no son únicos, generalmente no son útiles.
Por lo tanto, para modelos con varios parámetros, un solo experimento FRAP puede ser insuficiente para estimar todos los parámetros del modelo. Entonces se requieren más datos, por ejemplo, blanqueando áreas de diferentes tamaños, [13] determinando algunos parámetros del modelo de forma independiente, etc.
Ver también
- Microscopio de fluorescencia
- Fotoblanqueo
- Pérdida de fluorescencia en fotoblanqueo (FLIP)
Referencias
- ^ a b c Axelrod, D; Koppel, D; Schlessinger, J; Elson, E; Webb, W. (1976). "Medida de la movilidad mediante el análisis de la cinética de recuperación del fotoblanqueo por fluorescencia" . Revista biofísica . 16 (9): 1055–69. Código bibliográfico : 1976BpJ .... 16.1055A . doi : 10.1016 / S0006-3495 (76) 85755-4 . PMC 1334945 . PMID 786399 .
- ^ a b Sprague, Brian L .; Pego, Robert L .; Stavreva, Diana A .; McNally, James G. (2004). "Análisis de reacciones de unión por recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo" . Revista biofísica . 86 (6): 3473–95. Código Bibliográfico : 2004BpJ .... 86.3473S . doi : 10.1529 / biophysj.103.026765 . PMC 1304253 . PMID 15189848 .
- ^ a b c Kou Qin; Chunmin Dong; Guangyu Wu; Nevin A Lambert (agosto de 2011). "Premontaje de estado inactivo de receptores acoplados a Gq y heterotrímeros Gq" . Biología química de la naturaleza . 7 (11): 740–747. doi : 10.1038 / nchembio.642 . PMC 3177959 . PMID 21873996 .
- ^ Day, CA; Kraft, LJ; Kang, M; Kenworthy, AK (2012). "Análisis de la dinámica de proteínas y lípidos mediante recuperación de fluorescencia confocal tras fotoblanqueo (FRAP)" . Protocolos actuales en citometría . Capítulo 2: 2–19. doi : 10.1002 / 0471142956.cy0219s62 . PMC 3538152 . PMID 23042527 .
- ^ Mazza, D; Mueller, F; Stasevich, TJ; McNally, JG (2013). "Convergencia de las estimaciones de unión a cromatina en células vivas". Métodos Nat . 10 (8): 691–2. doi : 10.1038 / nmeth.2573 . PMID 23900248 . S2CID 27896929 .
- ^ Kou Qin; Pooja R. Sethi; Nevin A. Lambert (agosto de 2008). "Abundancia y estabilidad de complejos que contienen receptores acoplados a proteína G inactivos y proteínas G" . El diario FASEB . 22 (8): 2920–2927. doi : 10.1096 / fj.08-105775 . PMC 2493464 . PMID 18434433 .
- ^ Kraft, LJ; Kenworthy, AK (2012). "Formación de complejos de proteínas de imagen en la vía de la autofagia: análisis de la interacción de LC3 y Atg4B (C74A) en células vivas utilizando transferencia de energía de resonancia Förster y recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo" . J Biomed Opt . 17 (1): 011008. Bibcode : 2012JBO .... 17a1008K . doi : 10.1117 / 1.JBO.17.1.011008 . PMC 3380812 . PMID 22352642 .
- ^ Tripathi, K; Parnaik, VK (2008). "Dinámica diferencial del factor de empalme SC35 durante el ciclo celular". Revista de Biociencias . 33 (3): 345–54. doi : 10.1007 / s12038-008-0054-3 . PMID 19005234 . S2CID 6332495 .
- ^ Houtsmuller, AB (2005). "Recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo: aplicación a proteínas nucleares". Avances en Ingeniería Bioquímica / Biotecnología . 95 : 177–99. doi : 10.1007 / b102214 . ISBN 978-3-540-23698-6. PMID 16080269 .
- ^ Soumpasis, D (1983). "Análisis teórico de experimentos de recuperación de fotoblanqueo por fluorescencia" . Revista biofísica . 41 (1): 95–7. Código Bibliográfico : 1983BpJ .... 41 ... 95S . doi : 10.1016 / S0006-3495 (83) 84410-5 . PMC 1329018 . PMID 6824758 .
- ^ Yang, J .; Köhler, K .; Davis, DM; Burroughs, Nueva Jersey (2009). "Un método FRAP de tiras mejorado para estimar coeficientes de difusión: corrección del grado de fotoblanqueo". Revista de microscopía . 238 (3): 240–53. doi : 10.1111 / j.1365-2818.2009.03347.x . PMID 20579262 . S2CID 21797777 .
- ^ Castle, Brian T .; Howard, Stephen A .; Odde, David J. (2011). "Evaluación de los mecanismos de transporte subyacentes al gradiente de morfógeno bicoide" . Bioingeniería celular y molecular . 4 (1): 116-121. doi : 10.1007 / s12195-010-0157-4 . PMC 3164504 . PMID 21892361 .
- ^ a b González-Pérez, Vinicio; Schmierer, Bernhard; Hill, Caroline S .; Sear, Richard P. (2011). "Estudio de la dinámica de difusión intranuclear de Smad2 mediante el modelado matemático de experimentos FRAP". Biología integrativa . 3 (3): 197–207. doi : 10.1039 / c0ib00098a . PMID 21240396 .
- ^ a b Bulinski, JC; Odde, DJ; Howell, BJ; Salmón, TD; Waterman-Storer, CM (2001). "Dinámica rápida de la unión de microtúbulos de Ensconsin in vivo". Revista de ciencia celular . 114 (Pt 21): 3885–97. PMID 11719555 .
- ^ Sadegh Zadeh, Kouroush; Montas, Hubert J; Shirmohammadi, Adel (2006). "Identificación de parámetros de tasa de unión y transporte de masa de biomoléculas en células vivas mediante modelado inverso" . Biología teórica y modelización médica . 3 : 36. doi : 10.1186 / 1742-4682-3-36 . PMC 1635038 . PMID 17034642 .