Los formazanos son compuestos de fórmula general [RN = NC (R ') = N-NH-R "], formalmente derivados de formazan [H 2 NN = CHN = NH], desconocidos en forma libre. [1]
Los colorantes de formazán son productos cromogénicos artificiales de la reducción de sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas. Tienen una variedad de colores desde el azul oscuro hasta el rojo intenso y el naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizada como sustrato para la reacción.
Estructura y reactividad
Los formazanos son compuestos intensamente coloridos caracterizados por la siguiente estructura: [-N = NC (R) = N-NH-], [2] y están estrechamente relacionados con los colorantes azo (−N = N−). Su estructura fue definida por primera vez en 1892, por von Pechmann y por Bamberger y Wheelwright de forma independiente. [3] [4] Su color profundo y su química redox se derivan de su estructura rica en nitrógeno . [5]
Los formazanos tienen una gran flexibilidad conformacional y tautomérica . [5] Debido a los dos dobles enlaces alternos en la columna vertebral, los formazanos pueden existir en cuatro formas isoméricas posibles: syn, s-cis (forma cerrada); syn, s-trans (forma abierta); anti, s-cis; y anti, s-trans (forma lineal). [6]
Los formazanos 1,5-disustituidos pueden existir como dos tautómeros (1 y 2 en la imagen de abajo). Tras la desprotonación , el anión formado (3) se estabiliza por resonancia . Con iones de metales de transición ( Cu 2+ , Co 3+ , Ni 2+ , Zn 2+ , etc.), los formazanos forman complejos muy coloreados ( quelatos ).
Debido a su capacidad para reaccionar tanto con ácidos fuertes como con bases, los formazanos pueden considerarse anfóteros . [7]
La oxidación de tales compuestos da como resultado su conversión en sales de tetrazolio incoloras. Entre los diversos oxidantes utilizados se encuentran el óxido de mercurio, el ácido nítrico, el nitrito de isoamilo, la N-bromo succinimida, el permanganato de potasio, el tetraacetato de plomo y el hipoclorito de t-butilo. [8] Dependiendo de las condiciones, las sales de tetrazolio se pueden reducir para formar radicales tetrazolilo o formazán:
Síntesis
Existen varios métodos sintéticos para la síntesis de formazanos. [8] [9]
La reacción de compuestos de diazonio con aldehído hidrazonas es uno de los procedimientos más comunes para producir formazanos. Las hidrazonas, que son compuestos ricos en electrones, reaccionan con las sales de diazonio en un átomo de nitrógeno o de carbono para producir formazanos. Las sales de diazonio se acoplan al nitrógeno amínico en la hidrazona con el desplazamiento de un hidrógeno para dar el intermedio, que luego se reorganiza en el formazán. [10]
Otra forma de sintetizar formazanos es mediante la reacción de compuestos de metileno activos con sales de diazonio. Las sales de diazonio se agregan a los compuestos de metileno activos para formar un compuesto azo intermedio, seguido de la adición de una segunda sal de diazonio (en condiciones más alcalinas), produciendo tetrazeno , que luego forma un formazán 3-sustituido.
Los formazanos también se pueden producir mediante la oxidación de las hidrazidinas correspondientes, normalmente preparadas mediante la reacción de haluros de hidrazonilo con los derivados de hidrazina apropiados . Por ejemplo, el formato u ortoformiato de etilo reacciona con dos equivalentes de fenilhidrazina para producir 1,5-difenilformazán, en condiciones ácidas . En condiciones básicas, el nitrato de etilo reacciona en la posición de metileno para producir 3-metil-1,5-difenilformazano, que también se puede obtener de la reacción de fenilazoetano con nitrito de isoamilo .
Además, los formazanos pueden obtenerse mediante la descomposición de sales de tetrazolio sustituidas ya sea fotoquímicamente o bajo la influencia de ácido ascórbico en un medio alcalino . [11]
Solicitud
Las sales de tetrazolio y sus productos de formazán se utilizan ampliamente en métodos histoquímicos, especialmente en ensayos de viabilidad colorimétrica . Estos procedimientos se basan en la reducción del tetrazolio por las enzimas deshidrogenasas mitocondriales, que se transporta al interior de las células vivas:
Entre los principales ejemplos de las sales de tetrazolio más utilizadas se incluyen: [12]
- INT o cloruro de 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolio, que es insoluble en agua.
- MTT o bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio, que es insoluble en agua y se utiliza en el ensayo MTT .
- XTT o 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilida, que es soluble en agua.
- MTS o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, que es soluble en agua y se usa en el ensayo MTS .
- TTC o cloruro de tetrazolio o cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio, que es soluble en agua.
- NBT utilizado en una prueba de diagnóstico, particularmente para la enfermedad granulomatosa crónica y otras enfermedades de la función de los fagocitos.
Cuando se reduce en una célula, ya sea enzimáticamente o mediante reacción directa con NADH o NADPH , la sal clásica de tetrazolio, MTT, se vuelve azul a violeta y puede formar un precipitado insoluble. [13] [14] Estos colorantes de formazán se utilizan comúnmente en ensayos de proliferación celular y toxicidad , como las pruebas EpiDerm [15] y EpiSkin, ya que solo tiñen células vivas metabólicamente activas. [16] [17]
Referencias
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