Los fosmidos son similares a los cósmidos pero se basan en el plásmido F bacteriano . El vector de clonación es limitado, ya que un huésped (normalmente E. coli ) solo puede contener una molécula de fosmido. Los fósmidos pueden contener inserciones de ADN de hasta 40 kb de tamaño; a menudo, la fuente del inserto es ADN genómico aleatorio. Se prepara una biblioteca de fosmidos extrayendo el ADN genómico del organismo diana y clonándolo en el vector fosmídico. [1]Luego, la mezcla de ligación se empaqueta en partículas de fagos y el ADN se transfecta al hospedador bacteriano. Los clones bacterianos propagan la biblioteca de fosmidos. El bajo número de copias ofrece una mayor estabilidad que los vectores con números de copias relativamente más altos, incluidos los cósmidos. Los fosmidos pueden ser útiles para construir bibliotecas estables a partir de genomas complejos . Los fosmidos tienen una alta estabilidad estructural y se ha descubierto que mantienen el ADN humano de manera eficaz incluso después de 100 generaciones de crecimiento bacteriano. [2] Se utilizaron clones de fosmidos para ayudar a evaluar la precisión de la secuencia pública del genoma humano. [3]
Descubrimiento
El plásmido de fertilidad o plásmido F fue descubierto por Esther Lederberg y codifica información para la biosíntesis del pilus sexual para ayudar en la conjugación bacteriana. La conjugación implica el uso del pilus sexual para formar un puente entre dos células bacterianas; el puente permite que la célula F + transfiera una copia monocatenaria del plásmido para que ambas células contengan una copia del plásmido. En el camino hacia la célula receptora, el receptor sintetiza la cadena de ADN correspondiente. La célula donante mantiene una copia funcional del plásmido. Más tarde se descubrió que el factor F fue el primer episoma y puede existir como un plásmido independiente, lo que lo convierte en un vector muy estable para la clonación. La conjugación ayuda a la formación de bibliotecas de clones bacterianos asegurando que todas las células contengan el fosmido deseado. [4]
Los fosmidos son vectores de ADN que utilizan el origen del plásmido F de replicación y mecanismos de partición para permitir la clonación de grandes fragmentos de ADN. Se puede preparar fácilmente una biblioteca que proporcione una cobertura redundante de 20 a 70 veces del genoma. [5]
Bibliotecas de ADN
El primer paso para secuenciar genomas completos es clonar el genoma en unidades manejables de unas 50-200 kilobases de longitud. Es ideal utilizar una biblioteca de fosmidos debido a su estabilidad y limitación de un plásmido por célula. Al limitar el número de plásmidos en las células, se reduce el potencial de recombinación, preservando así el inserto del genoma. [6]
Los fosmidos contienen varios elementos funcionales:
- OriT (Origen de la transferencia): La secuencia que marca el punto de partida de la transferencia conjugativa.
- OriV (origen de replicación): la secuencia a partir de la cual el ADN plásmido se replicará en la célula receptora.
- tra-región (genes de transferencia): genes que codifican el proceso de transferencia de ADN y F-Pilus.
- IS (Elementos de inserción): los denominados "genes egoístas" (fragmentos de secuencia que pueden integrar copias de sí mismos en diferentes ubicaciones).
Se han perfeccionado los métodos de corte e inserción de ADN en vectores fosmídicos. En la actualidad, hay muchas empresas que pueden crear una biblioteca de fosmidos a partir de cualquier muestra de ADN en un período de tiempo muy corto a un costo relativamente bajo. Esto ha sido vital para permitir a los investigadores secuenciar numerosos genomas para su estudio. A través de una variedad de métodos, se han secuenciado completamente más de 6651 genomas de organismos, con 58,695 en curso. [7]
Usos
A veces es difícil distinguir con precisión los cromosomas individuales en función de la longitud de los cromosomas, la proporción de brazos y el patrón de bandas C. Los fosmidos pueden usarse como marcadores citológicos confiables para la identificación de cromosomas individuales y los cariotipos de cromosomas en metafase basados en hibridación in situ fluorescentes pueden usarse para mostrar si las posiciones de estos fosmidos se construyeron con éxito. [8]
El sistema de fosmidos es excelente para crear rápidamente bibliotecas mini-BAC específicas de cromosomas a partir de ADN cromosómico clasificado por flujo. La principal ventaja de Fosmids sobre otros sistemas de cósmidos radica en su capacidad de propagar de forma estable fragmentos de ADN humano. [9] De naturaleza altamente repetitiva, el ADN humano es bien conocido por su extrema inestabilidad en los sistemas de vectores multicopia. Se ha encontrado que la estabilidad aumenta drásticamente cuando los insertos de ADN humano están presentes en copias individuales en células de E. coli deficientes en recombinación . Por lo tanto, los fosmidos sirven como sustratos confiables para la secuenciación de ADN genómico a gran escala. [2]
Referencias
- ^ Hall BG (mayo de 2004). "Predicción de la evolución de genes de resistencia a antibióticos". Reseñas de la naturaleza. Microbiología . 2 (5): 430–5. doi : 10.1038 / nrmicro888 . PMID 15100696 .
- ^ a b Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (septiembre de 1992). "Clonación y mantenimiento estable de fragmentos de 300 kilopares de bases de ADN humano en Escherichia coli utilizando un vector basado en el factor F" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 89 (18): 8794–7. Código Bibliográfico : 1992PNAS ... 89.8794S . doi : 10.1073 / pnas.89.18.8794 . PMC 50007 . PMID 1528894 .
- ^ Kim UJ, Shizuya H, de Jong PJ, Birren B, Simon MI (marzo de 1992). "Propagación estable de inserciones de ADN humano de tamaño cósmido en un vector basado en el factor F" . Investigación de ácidos nucleicos . 20 (5): 1083–5. doi : 10.1093 / nar / 20.5.1083 . PMC 312094 . PMID 1549470 .
- ^ Bauman, Robert. Microbiología con enfermedades por taxonomía (3ª ed.). Prensa de educación de Pearson. pag. 218.
- ^ \ Kim UJ, Shizuya H, Sainz J, Garnes J, Pulst SM, de Jong P, Simon MI (octubre de 1995). "Construcción y utilidad de una biblioteca Fosmid específica del cromosoma 22 humano". Análisis genético: Ingeniería Biomolecular . 12 (2): 81–4. doi : 10.1016 / 1050-3862 (95) 00122-0 . PMID 8574898 .
- ^ Gibson, Greg. Muse, Spencer. "Una cartilla de la ciencia del genoma". Tercera edicion. Asociados Sinauer p.84-85
- ^ "JGI GOLD - Inicio" . gold.jgi-psf.org .
- ^ Liu, C 2010 Cariotipado en melón (Cucumis melo L.) por hibridación in situ de fluorescencia fosmídica de especies cruzadas, INVESTIGACIÓN CITOGENÉTICA Y GENOMA
- ^ Tursun B, Cochella L, Carrera I, Hobert O (2009). "Un conjunto de herramientas y una tubería robusta para la generación de genes informadores basados en fosmidos en C. elegans" . PLOS ONE . 4 (3): e4625. Código bibliográfico : 2009PLoSO ... 4.4625T . doi : 10.1371 / journal.pone.0004625 . PMC 2649505 . PMID 19259264 .
enlaces externos
- Un ejemplo de un fosmid mapeado
- Base de datos de nucleótidos NCBI