Kaede es una proteína fluorescente fotoactivable que se origina naturalmente a partir de un coral pétreo , Trachyphyllia geoffroyi . Su nombre significa "arce" en japonés . Con la irradiación de luz ultravioleta (350–400 nm), Kaede sufre una fotoconversión irreversible de fluorescencia verde a fluorescencia roja.
Kaede es una proteína homotetramérica con un tamaño de 116 kDa . La estructura tetramérica se dedujo ya que su estructura primaria es de solo 28 kDa. Esta tetramerización posiblemente hace que Kaede tenga una baja tendencia a formar agregados cuando se fusiona con otras proteínas.
Descubrimiento [ editar ]
La propiedad de la proteína Kaede de fluorescencia fotoconvertida fue descubierta por casualidad y reportada por primera vez por Ando et al. en Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos . [1] Se descubrió que una alícuota de proteína Kaede emite fluorescencia roja después de dejarse en el banco y exponerse a la luz solar. La verificación posterior reveló que Kaede, que originalmente es verde fluorescente, después de la exposición a la luz ultravioleta se fotoconvierte, volviéndose rojo fluorescente. Luego se llamó Kaede.
Propiedades [ editar ]
La propiedad de fotoconversión en Kaede es aportada por el tripéptido , His62-Tyr63-Gly64, que actúa como un cromóforo verde que puede convertirse en rojo. [2] Una vez que se sintetiza Kaede, un cromóforo, 4- (p-hidroxibencilideno) -5-imidazolinona, derivado del tripéptido media la fluorescencia verde en Kaede. Cuando se expone a los rayos UV, la proteína Kaede sufre una escisión no convencional entre el nitrógeno de la amida y el carbono α (Cα) en His62 mediante una reacción formal de eliminación β. Seguido por la formación de un doble enlace entre His62-Cα y -Cβ, la conjugación π se extiende al anillo de imidazol de His62. Se forma un nuevo cromóforo, 2 - [(1E) -2- (5-imidazolil) etenil] -4- (p-hidroxibenciliden) -5-imidazolinona, con la propiedad de emisión de rojo.
La escisión del tripéptido se analizó mediante análisis SDS-PAGE. Kaede verde sin convertir muestra una banda a 28 kDa, donde se observan dos bandas a 18 kDa y 10 kDa para Kaede rojo convertido, lo que indica que la escisión es crucial para la fotoconversión. [ cita requerida ]
Un cambio del espectro de absorción y emisión en Kaede es causado por la escisión del tripéptido. Antes de la fotoconversión, Kaede muestra un máximo de longitud de onda de absorción importante a 508 nm, acompañado de un ligero hombro a 475 nm. Cuando se excita a 480 nm, se emite fluorescencia verde con un pico de 518 nm. Cuando Kaede se irradia con luz ultravioleta o violeta, el pico de absorción principal se desplaza a 572 nm. Cuando se excitó a 540 nm, Kaede mostró un máximo de emisión a 582 nm con un hombro a 627 nm y el pico de 518 nm. Se emite fluorescencia roja después de esta fotoconversión.
La fotoconversión en Kaede es irreversible. La exposición en la oscuridad o la iluminación a 570 nm no puede restaurar su fluorescencia verde original. Se observa una fluorescencia reducida en Kaede rojo fotoconvertido cuando se expone intensamente a luz de 405 nm, seguido de una recuperación parcial después de varios minutos.
Aplicaciones [ editar ]
Como todas las demás proteínas fluorescentes, Kaede puede ser los marcadores ópticos regionales para la expresión génica y el etiquetado de proteínas para el estudio de los comportamientos celulares. [3]
Una de las aplicaciones más útiles es la visualización de neuronas . La delimitación de una neurona individual es difícil debido a los procesos largos y delgados que se entrelazan con otras neuronas. Incluso cuando las neuronas cultivadas se marcan con proteínas fluorescentes, siguen siendo difíciles de identificar individualmente debido al paquete denso.
En el pasado, dicha visualización se podía realizar de manera convencional llenando las neuronas con amarillo Lucifer o sulforrodamina , que es una técnica laboriosa. [1] Después del descubrimiento de la proteína Kaede, se descubrió que era útil para delinear neuronas individuales. Las neuronas son transfectadas por el ADNc de la proteína Kaede.y son irradiados con UV. La proteína Kaede roja fotoconvertida tiene difusibilidad libre en la célula, excepto en el núcleo, y se extiende por toda la célula, incluidas las dendritas y el axón. Esta técnica ayuda a desenredar las complejas redes establecidas en una cultura densa. Además, al marcar las neuronas con diferentes colores mediante irradiación UV con diferentes tiempos de duración, se permite visualizar los sitios de contacto entre las neuronas rojas y verdes de interés. [1]
La capacidad de visualización de células individuales también es una herramienta poderosa para identificar la morfología precisa y los comportamientos migratorios de células individuales dentro de cortes corticales vivos . Mediante la proteína Kaede, se puede seguir un par particular de células hijas en células vecinas positivas a Kaede en la zona ventricular de cortes de cerebro de ratón . Se visualizan los bordes célula-célula de las células hijas y se puede describir la posición y la distancia entre dos o más células. [4]
Como el cambio en el color fluorescente es inducido por la luz ultravioleta, el marcado de células y estructuras subcelulares es eficaz incluso cuando solo se induce una fotoconversión parcial.
Ventajas como marcador óptico [ editar ]
Debido a la propiedad especial de la fluorescencia fotoconmutable, la proteína Kaede posee varias ventajas como marcador óptico de células .
Después de la fotoconversión, la proteína Kaede fotoconvertida emite fluorescencia roja brillante y estable. Esta fluorescencia puede durar meses sin condiciones anaeróbicas. Como este estado rojo de Kaede es brillante y estable en comparación con el estado verde, y debido a que el Kaede verde no convertido emite una intensidad muy baja de fluorescencia roja, las señales rojas proporcionan contraste. [1]
Además, antes de la fotoconversión, Kaede emite una fluorescencia verde brillante que permite visualizar la localización de la proteína no fotoacivada. Esto es superior a otras proteínas fluorescentes como PA-GFP y KFP1, que solo muestran una baja fluorescencia antes de la fotoactivación. [3]
Además, como la fluorescencia verde y roja de Kaede se excita con luz azul a 480 nm para la observación, esta luz no inducirá la fotoconversión. Por tanto, las luces de iluminación para observación y fotoconversión se pueden separar por completo.
Limitaciones [ editar ]
A pesar de la utilidad de Kaede en el seguimiento y visualización de células, existen algunas limitaciones. Aunque Kaede cambiará a rojo al exponerse a la luz ultravioleta o violeta y mostrará un aumento de 2000 veces en la proporción de fluorescencia de rojo a verde, el uso de las bandas de fluorescencia roja y verde puede causar problemas en los experimentos de múltiples etiquetas. La tetramerización de Kaede puede alterar la localización y el tráfico de proteínas de fusión. Esto limita la utilidad de Kaede como etiqueta de proteína de fusión .
Importancia ecológica [ editar ]
La propiedad de fotoconversión de Kaede no solo contribuye a la aplicación en el etiquetado de proteínas y el seguimiento celular, sino que también es responsable de la gran variación en el color de los corales pétreos, Trachyphyllia geoffroyi . Bajo la luz del sol, debido a la fotoconversión de Kaede, los tentáculos y los discos se volverán rojos. A medida que se sintetiza continuamente Kaede verde fluorescente , estos corales vuelven a aparecer verdes a medida que se crea más Kaede no convertido. Por la diferente proporción de Kaede fotoconvertida y no convertida, se encuentra una gran diversidad de color en los corales.
Referencias [ editar ]
- Tomura, M .; Yoshida, N .; Tanaka, J .; Karasawa, S .; Miwa, Y .; Miyawaki, A .; Kanagawa, O. (2008). "Seguimiento del movimiento celular in vivo con proteína de fluorescencia fotoconvertible" Kaede "ratones transgénicos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 105 (31): 10871–10876. Código bibliográfico : 2008PNAS..10510871T . doi : 10.1073 / pnas.0802278105 . PMC 2504797 . PMID 18663225 .
- Dittrich, PS; Schäfer, SP; Schwille, P. (2005). "Caracterización de la fotoconversión en la reacción de la proteína fluorescente Kaede en el nivel de una sola molécula" . Revista biofísica . 89 (5): 3446–3455. Código Bibliográfico : 2005BpJ .... 89.3446D . doi : 10.1529 / biophysj.105.061713 . PMC 1366840 . PMID 16055537 .
- ↑ a b c Ando, R. (2002). "Un marcador óptico basado en la fotoconversión de verde a rojo inducida por UV de una proteína fluorescente" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 99 (20): 12651–12656. Código bibliográfico : 2002PNAS ... 9912651A . doi : 10.1073 / pnas.202320599 . PMC 130515 . PMID 12271129 .
- ^ Mizuno, H .; Mal, TK; Tong, KI; Ando, R .; Furuta, T .; Ikura, M .; Miyawaki, A. (2003). "Escisión de péptidos fotoinducidos en la conversión de verde a rojo de una proteína fluorescente". Célula molecular . 12 (4): 1051–1058. doi : 10.1016 / s1097-2765 (03) 00393-9 . PMID 14580354 .
- ↑ a b Lippincott-Schwartz, J .; Altan-Bonnet, N .; Patterson, GH (2003). "Fotoblanqueo y fotoactivación: seguimiento de la dinámica de proteínas en células vivas". Biología celular de la naturaleza . Supl: S7-14. doi : 10.1038 / ncb1032 (inactivo 2021-01-11). PMID 14562845 . CS1 maint: DOI inactive as of January 2021 (link)
- ^ Mutoh, T .; Miyata, T .; Kashiwagi, S .; Miyawaki, A .; Ogawa, M. (2006). "Comportamiento dinámico de las células individuales en el desarrollo de cortes de cerebro organotípicos revelados por la proteína fotoconvertible Kaede". Neurología experimental . 200 (2): 430–437. doi : 10.1016 / j.expneurol.2006.03.022 . PMID 16753144 . S2CID 22238647 .
