HaloTag es una etiqueta de proteína autoetiquetable . Es un péptido de 297 residuos (33 kDa) derivado de una enzima bacteriana , diseñado para unirse covalentemente a un ligando sintético. La enzima bacteriana se puede fusionar con varias proteínas de interés. [1] El ligando sintético se elige entre varios ligandos disponibles de acuerdo con el tipo de experimentos a realizar. Esta enzima bacteriana es una haloalcano deshalogenasa , que actúa como hidrolasa y está diseñada para facilitar la visualización de la localización subcelular de una proteína de interés, la inmovilización de una proteína de interés o la captura de los socios de unión de una proteína de interés dentro de su estructura bioquímica. ambiente. [2]El HaloTag se compone de dos segmentos unidos covalentemente que incluyen una haloalcano deshalogenasa y un ligando sintético de elección. Estos ligandos sintéticos consisten en un enlazador de cloroalcano reactivo unido a un grupo funcional. [3] Los grupos funcionales pueden ser biotina (se pueden usar como una etiqueta de afinidad) o se pueden elegir entre cinco tintes fluorescentes disponibles que incluyen cumarina, verde de Oregon, Alexa Fluor 488, diAcFAM y TMR. Estos tintes fluorescentes se pueden utilizar en la visualización de células vivas o fijadas químicamente. [4]
Mecanismo
El HaloTag es una hidrolasa, que tiene un sitio activo modificado genéticamente, que se une específicamente al engarce de cloroalcano reactivo y tiene una mayor tasa de unión al ligando. [5] La reacción que forma el enlace entre la etiqueta de proteína y el enlazador de cloroalcano es rápida y esencialmente irreversible en condiciones fisiológicas debido al cloro terminal de la porción del enlazador. [6] En la reacción antes mencionada, el ataque nucleofílico del enlazador reactivo de cloroalcano provoca el desplazamiento del halógeno con un residuo de aminoácido, lo que da como resultado la formación de un intermedio de alquil-enzima covalente. Este intermedio luego sería hidrolizado por un residuo de aminoácido dentro de la hidrolasa de tipo salvaje. [7] Esto conduciría a la regeneración de la enzima después de la reacción. Sin embargo, en la haloalcano deshalogenasa modificada (HaloTag), el intermedio de reacción no puede continuar con una reacción posterior porque no puede hidrolizarse debido a la mutación en la enzima. Esto hace que el intermedio persista como un aducto covalente estable con el que no existe una reacción inversa asociada. [8]
Usos
Las proteínas de fusión etiquetadas con halo se pueden expresar usando técnicas estándar de expresión de proteínas recombinantes . [9] Además, hay varios vectores comerciales disponibles que solo requieren la inserción de un gen de interés. [10] Dado que las deshalogenasas bacterianas son relativamente pequeñas y las reacciones descritas anteriormente son ajenas a las células de los mamíferos, no hay interferencia por las reacciones metabólicas endógenas de los mamíferos. [11] Una vez que se ha expresado la proteína de fusión, existe una amplia gama de áreas potenciales de experimentación que incluyen ensayos enzimáticos, imágenes celulares, matrices de proteínas, determinación de la localización subcelular y muchas posibilidades adicionales. [12]
Ver también
Referencias
- ^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C, et al. (Junio de 2008). "HaloTag: una nueva tecnología de etiquetado de proteínas para la obtención de imágenes celulares y el análisis de proteínas". Biología Química ACS . 3 (6): 373–82. doi : 10.1021 / cb800025k . PMID 18533659 .
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