El hemocitómetro (o hemocitómetro) es un dispositivo de cámara de recuento diseñado originalmente y generalmente utilizado para el recuento de células sanguíneas . [1]
El hemocitómetro fue inventado por Louis-Charles Malassez y consiste en un portaobjetos de microscopio de vidrio grueso con una muesca rectangular que crea una cámara de volumen de precisión. Esta cámara está grabada con una rejilla de líneas perpendiculares grabada con láser . El dispositivo está cuidadosamente diseñado para que se conozca el área delimitada por las líneas y también se conozca la profundidad de la cámara. Por lo tanto, al observar un área definida de la cuadrícula, es posible contar el número de células o partículas en un volumen específico de líquido y, por lo tanto, calcular la concentración de células en el líquido en general. Un tipo de hemocitómetro muy utilizado es la cámara de recuento Neubauer . [2]
Otros tipos de hemocitómetros con diferentes reglas se utilizan para diferentes aplicaciones. Las reglas de Fuchs-Rosenthal, comúnmente utilizadas para el recuento de líquido cefalorraquídeo, las reglas de Howard Mold que se usan para el moho en los alimentos y los productos de envasado de alimentos, las reglas de McMaster Egg Slide que se usan para contar huevos microbianos en la materia fecal, las reglas de la cámara Nageotte para contar los niveles bajos de glóbulos blancos en blanco componentes de plaquetas con células reducidas, regla de Palmer Nanoplancton para contar plankters más pequeños. El contador Petroff-Hausser que utiliza reglas de Neubauer mejoradas se utiliza para el recuento de bacterias y espermatozoides y se ofrece con diferentes profundidades de cámara. La regla Sedgwick-Rafter Cell en un hemocitómetro está diseñada principalmente para su uso en la microscopía de agua potable.
Principios
El área cuadriculada del hemocitómetro mejorado Neubauer reglado consta de nueve cuadrados de 1 x 1 mm (1 mm 2 ). Estos se subdividen en tres direcciones; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm 2 ), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm 2 ) y 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm 2 ). El cuadrado central se subdivide a su vez en cuadrados de 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm 2 ). Los bordes elevados del hemocitómetro sostienen el cubreobjetos a 0,1 mm de la cuadrícula marcada, lo que le da a cada cuadrado un volumen definido (ver figura a la derecha). [3]
Dimensiones | Área | Volumen a 0,1 mm de profundidad |
---|---|---|
1 x 1 mm | 1 mm 2 | 100 nL |
0,25 x 0,25 mm | 0,0625 mm 2 | 6,25 nL |
0,25 x 0,20 mm | 0,05 mm 2 | 5 nL |
0,20 x 0,20 mm | 0,04 mm 2 | 4 nL |
0,05 x 0,05 mm | 0,0025 mm 2 | 0,25 nL |
Uso
Para usar el hemocitómetro, primero asegúrese de que el cubreobjetos especial provisto con la cámara de conteo esté colocado correctamente en la superficie de la cámara de conteo. Cuando las dos superficies de vidrio están en contacto adecuado , se pueden observar los anillos de Newton . Si es así, la suspensión celular se aplica al borde del cubreobjetos para ser succionada al vacío por acción capilar que llena completamente la cámara con la muestra. El número de células en la cámara se puede determinar mediante recuento directo usando un microscopio , y las células visualmente distinguibles se pueden contar de forma diferencial. El número de células en la cámara se utiliza para calcular la concentración o densidad de las células en la mezcla de la que proviene la muestra. Es el número de células en la cámara dividido por el volumen de la cámara, que se conoce desde el principio, teniendo en cuenta las diluciones y los atajos de conteo:
donde el volumen de la muestra diluida (después de la dilución) dividido por el volumen de la mezcla original en la muestra (antes de la dilución) es el factor de dilución . Por ejemplo, si el volumen de la mezcla original era de 20 μL y se diluyó una vez (agregando 20 μL de diluyente), entonces el segundo término entre paréntesis es 40 μL / 20 μL. El volumen de los cuadrados contados es el que se muestra en la tabla de la parte superior, en función del tamaño (ver figura de la derecha). El número de células contadas es la suma de todas las células contadas en cuadrados en una cámara. La proporción de las celdas contadas se aplica si no se cuentan todos los cuadrados interiores dentro de un cuadrado establecido (es decir, si solo se cuentan 4 de los 20 en un cuadrado de esquina, entonces este término será igual a 0,2).
Para la mayoría de las aplicaciones, solo se utilizan los cuatro cuadrados de esquina grandes. Se cuentan las celdas que están en o tocando las líneas superior e izquierda, pero las que están en o tocando las líneas derecha o inferior se ignoran. [5]
Requisitos
La suspensión original debe mezclarse completamente antes de tomar una muestra. Esto asegura que la muestra sea representativa y no solo un artefacto de la región particular de la mezcla original de la que se extrajo.
Debe utilizarse una dilución adecuada de la mezcla con respecto al número de células a contar. Si la muestra no se diluye lo suficiente, las células estarán demasiado pobladas y serán difíciles de contar. Si está demasiado diluido, el tamaño de la muestra no será suficiente para hacer inferencias sólidas sobre la concentración en la mezcla original.
Al realizar una prueba redundante en una segunda cámara, se pueden comparar los resultados. Si difieren más de 2 veces el error de recuento (raíz cuadrada del recuento [6] ), el método para tomar la muestra puede no ser confiable (por ejemplo, la mezcla original no se mezcla completamente).
La cámara de recuento debe llenarse por capilaridad después de que se haya colocado la tapa de la cámara (cubreobjetos especial con espesor y planitud certificados). Esto evita el riesgo de que las células sedimenten / se adhieran al vidrio o que se evapore algo de volumen antes de que se coloque el cubreobjetos en la parte superior, lo que resultará en una sobreestimación de la concentración de células. La sedimentación es un problema menor con las bacterias, pero la evaporación, más frecuente en los laboratorios con aire acondicionado de baja humedad, aún debe minimizarse.
Aplicaciones
- Recuentos sanguíneos : para pacientes con células sanguíneas anormales, donde los contadores automáticos no funcionan bien.
- Recuentos de esperma
- Cultivo celular: cuando se subcultiva o se registra el crecimiento celular a lo largo del tiempo.
- Elaboración de cerveza : para la preparación de la levadura.
- Recuento de células de fitoplancton
- Procesamiento de células para análisis posteriores: se necesitan números de células precisos en muchas pruebas ( PCR , citometría de flujo ), mientras que otras requieren una alta viabilidad celular.
- Medición del tamaño celular: en una micrografía, el tamaño celular real se puede inferir escalando al ancho de un cuadrado de hemocitómetro, que se conoce. [7]
Referencias
- ^ Absher, Marlene (1973). "Recuento de hemocitómetros". Cultivo de tejidos . págs. 395–397. doi : 10.1016 / B978-0-12-427150-0.50098-X . ISBN 9780124271500.
- ^ "Fig. 8. Vistas de un portaobjetos de hemocitómetro gobernante Neubauer mejorado. (A) Vista superior ..." ResearchGate . Consultado el 29 de marzo de 2018 .
- ^ "Hemocitómetro: tamaños cuadrados" .
- ^ "Conteo celular con cámara de Neubauer - Uso básico del hemocitómetro, Óscar Bastidas" (PDF) .
- ^ Strober W (2001). "Seguimiento del crecimiento celular". En Coligan JE, Bierer BE, Margulies DH, Sherach EM, Strober W (eds.). Protocolos actuales en inmunología . 5 . Estados Unidos: John Wiley & Sons. pag. A.2A.1. doi : 10.1002 / 0471142735.ima03as21 . ISBN 0471142735. PMID 18432653 .
- ^ Shapiro, Howard (31 de enero de 2001). "eventos muy raros: ¿qué tan bajo puedes llegar?" .
- ^ "Medición del tamaño celular con un hemocitómetro" . Archivado desde el original el 29 de junio de 2012 . Consultado el 2 de junio de 2013 .
enlaces externos
- Ejercicio en línea : recuentos de levadura mejorados en Neubauer o cámaras de recuento Thoma
- Calculadora de hemocitómetro en línea