El recuento de células es cualquiera de los diversos métodos para el recuento o cuantificación similar de células en las ciencias de la vida , incluido el diagnóstico y el tratamiento médicos . Es un subconjunto importante de la citometría , con aplicaciones en la investigación y la práctica clínica. Por ejemplo, el hemograma completo puede ayudar a un médico a determinar por qué un paciente se siente mal y qué hacer para ayudar. Recuento de células en medios líquidos (como sangre , plasma , linfa o enjuague de laboratorio) se expresan generalmente como un número de células por unidad de volumen , expresando así una concentración (por ejemplo, 5.000 células por mililitro).
Usos
Numerosos procedimientos en biología y medicina requieren el recuento de células. Mediante el recuento de células en un volumen pequeño conocido , se puede mediar la concentración. Ejemplos de la necesidad de contar células incluyen:
- En medicina, la concentración de varios glóbulos , como glóbulos rojos y glóbulos blancos , puede proporcionar información crucial sobre la situación de salud de una persona (ver: hemograma completo ).
- En terapia celular , para controlar la dosis de células administrada a un paciente.
- De manera similar, la concentración de bacterias , virus y otros patógenos en la sangre o en otros fluidos corporales puede revelar información sobre el progreso de una enfermedad infecciosa y sobre el grado de éxito con el que el sistema inmunológico está lidiando con la infección .
- La concentración de células debe conocerse para muchos experimentos de biología molecular, con el fin de ajustar en consecuencia la cantidad de reactivos y productos químicos que se aplicarán en el experimento.
- Los estudios que examinan la tasa de crecimiento de los microorganismos (en otras palabras, qué tan rápido se dividen para crear nuevas células) requieren un recuento celular.
- Calcular la fracción de células muertas a vivas como una medida de la viabilidad celular, como las células expuestas al veneno.
Conteo celular manual
Existen varios métodos para el recuento celular. Algunas son primitivas y no requieren de equipos especiales, por lo que pueden realizarse en cualquier laboratorio biológico , mientras que otras dependen de sofisticados aparatos electrónicos.
Cámara de recuento
Una cámara de recuento es un portaobjetos de microscopio especialmente diseñado para permitir el recuento celular. Los hemocitómetros y las cámaras de recuento Sedgewick Rafter son dos tipos de cámaras de recuento. El hemocitómetro tiene dos cámaras cuadriculadas en el medio, que se cubren con un portaobjetos de vidrio especial cuando se realiza el recuento. Se coloca una gota de cultivo celular en el espacio entre la cámara y la tapa de vidrio, llenándolo por capilaridad . [1] Al observar la muestra bajo el microscopio , el investigador usa la cuadrícula para contar manualmente el número de células en un área determinada de tamaño conocido. La distancia de separación entre la cámara y la tapa está predefinida, por lo que se puede calcular el volumen del cultivo contado y con él la concentración de células. La viabilidad celular también se puede determinar si se añaden tintes de viabilidad al fluido.
Su ventaja es que son baratos y rápidos; esto los convierte en el método de recuento preferido en experimentos biológicos rápidos en los que solo es necesario determinar si un cultivo celular ha crecido como se esperaba. Por lo general, el cultivo examinado debe diluirse; de lo contrario, la alta densidad de células haría imposible el recuento. La necesidad de dilución es una desventaja ya que cada dilución agrega inexactitud a la medición. [2]
Recuento de placas y CFU
Para cuantificar el número de células en un cultivo, las células se pueden plaquear simplemente en una placa de Petri con medio de crecimiento . Si las células se distribuyen de manera eficiente en la placa, se puede suponer generalmente que cada célula dará lugar a una sola colonia o unidad formadora de colonias (UFC) . A continuación, se pueden contar las colonias y, basándose en el volumen de cultivo conocido que se extendió sobre la placa, se puede calcular la concentración de células. Esto a menudo se lleva a cabo siguiendo la norma ASTM D5465. [3]
Como ocurre con las cámaras de recuento, los cultivos generalmente deben diluirse en gran medida antes de la siembra en placas; de lo contrario, en lugar de obtener colonias individuales que se puedan contar, se formará un llamado "césped": miles de colonias superpuestas. Además, el enchapado es el método más lento de todos: la mayoría de los microorganismos necesitan al menos 12 horas para formar colonias visibles.
Aunque este método puede llevar mucho tiempo, proporciona una estimación precisa del número de células viables (porque solo ellas podrán crecer y formar colonias visibles). Por lo tanto, se utiliza ampliamente en experimentos destinados a cuantificar el número de células que resisten a los fármacos u otras condiciones externas (por ejemplo, el experimento de Luria-Delbrück o el ensayo de protección con gentamicina ). Además, la enumeración de colonias en placas de agar se puede facilitar en gran medida mediante el uso de contadores de colonias .
Conteo celular automatizado
Resistencia eléctrica
Un contador Coulter es un aparato que puede contar células y medir su volumen. Se basa en el hecho de que las células presentan una gran resistencia eléctrica ; en otras palabras, casi no conducen electricidad . En un contador Coulter, las células, que nadan en una solución que conduce la electricidad, son succionadas una a una en un pequeño espacio. Flanqueando la brecha hay dos electrodos que conducen la electricidad. Cuando no hay ninguna celda en el espacio, la electricidad fluye sin cesar, pero cuando se succiona una celda en el espacio, se resiste la corriente. El contador Coulter cuenta el número de tales eventos y también mide la corriente (y por lo tanto la resistencia), que se correlaciona directamente con el volumen de la celda atrapada. Un sistema similar es la tecnología de conteo de células CASY .
Los contadores Coulter y CASY son mucho más baratos que los citómetros de flujo, y para aplicaciones que requieren números y tamaños de células , como la investigación del ciclo celular , son el método de elección. Su ventaja sobre los métodos anteriores es la gran cantidad de células que se pueden procesar en poco tiempo, a saber: miles de células por segundo. Esto ofrece una gran precisión y significación estadística .
Citometría de flujo
La citometría de flujo es, con mucho, el método más sofisticado y costoso para el recuento celular. En un citómetro de flujo, las células fluyen en una corriente estrecha frente a un rayo láser . El rayo los golpea uno por uno y un detector de luz capta la luz que se refleja en las células.
Los citómetros de flujo tienen muchas otras capacidades, como analizar la forma de las células y sus estructuras internas y externas, así como medir la cantidad de proteínas específicas y otros bioquímicos en las células. Por lo tanto, los citómetros de flujo rara vez se compran con el único propósito de contar células. [ cita requerida ]
Análisis de imagen
Los enfoques recientes consideran el uso de imágenes de microscopía de alta calidad sobre las cuales se usa un algoritmo de clasificación estadística para realizar la detección y el conteo de células automatizados como una tarea de análisis de imágenes . [4] Generalmente funciona con una tasa de error constante como un proceso de tipo fuera de línea (por lotes). Se puede emplear una variedad de técnicas de clasificación de imágenes para este propósito. [5]
Recuento de células estereológicas
En la actualidad, el recuento de células estereológicas con decisión manual para la inclusión de objetos de acuerdo con reglas de recuento estereológico no sesgadas sigue siendo el único método adecuado para la cuantificación de células no sesgadas en secciones de tejido histológico, por lo que no es lo suficientemente adecuado como para ser completamente automatizado. [6]
Recuento celular indirecto
Espectrofotometria
Las suspensiones celulares son turbias . Las células absorben y dispersan la luz. Cuanto mayor sea la concentración celular, mayor será la turbidez. Los espectrofotómetros pueden medir la intensidad de la luz con mucha precisión. El cultivo celular se coloca en una cubeta transparente y la absorción se mide en relación con el medio solo. La densidad óptica (DO) es directamente proporcional a la biomasa en la suspensión celular en un rango dado que es específico del tipo celular. El uso de espectrofotometría para medir la turbidez de cultivos se conoce como turbidometría .
Esto ha hecho de la espectrofotometría el método de elección para medir el crecimiento bacteriano y aplicaciones relacionadas. El inconveniente de la espectrofotometría es su incapacidad para proporcionar un recuento absoluto o distinguir entre células vivas y muertas.
Microbiología de impedancia
La microbiología de impedancia es una técnica microbiológica rápida que se utiliza para medir la concentración microbiana (principalmente bacterias pero también levaduras ) de una muestra mediante el seguimiento de los parámetros eléctricos del medio de cultivo. Se basa en el hecho de que el metabolismo de las bacterias transforma los compuestos no cargados (o cargados débilmente) en compuestos altamente cargados, cambiando así las propiedades eléctricas del medio de crecimiento . La concentración microbiana se estima en el tiempo necesario para que los parámetros eléctricos controlados se desvíen del valor de referencia inicial.
Se encuentran disponibles diferentes instrumentos (construidos en un laboratorio o disponibles comercialmente) para medir la concentración bacteriana utilizando microbiología de impedancia. [7] [8] [9] [10] [11]
Referencias
- ^ "Protocolo de hemocitómetro" . 2013-04-04.
- ^ "Uso básico del hemocitómetro" .
- ^ Hanaor, Dorian AH; Michelazzi, Marco; Chenu, Jeremy W .; Leonelli, Cristina; Sorrell, Charles (marzo de 2013). "Los efectos de las condiciones de cocción sobre las propiedades de las películas de dióxido de titanio depositadas electroforéticamente sobre sustratos de grafito" . Revista de la Sociedad Europea de Cerámica . 31 (15). arXiv : 1303.2757 . doi : 10.1016 / j.jeurceramsoc.2011.07.007 .
- ^ Han, JW; Breckon, TP; Randell, DA; Landini, G. (2012). "La aplicación de la clasificación de la máquina de vectores de soporte para detectar núcleos celulares para microscopía automatizada" (PDF) . Visión artificial y aplicaciones . 23 (1): 15-24. doi : 10.1007 / s00138-010-0275-y . Consultado el 8 de abril de 2013 . CS1 maint: parámetro desalentado ( enlace )
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- ^ Schmitz; et al. (7 de mayo de 2014). "Los métodos de detección de células 3D automatizados actuales no son un reemplazo adecuado para el recuento manual de células estereológicas" . Fronteras en neuroanatomía . 8 : 27. doi : 10.3389 / fnana.2014.00027 . PMC 4019880 . PMID 24847213 .
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