El intercambio de hidrógeno-deuterio (también llamado intercambio H-D o H / D) es una reacción química en la que un átomo de hidrógeno unido covalentemente es reemplazado por un átomo de deuterio , o viceversa. Se puede aplicar más fácilmente a protones y deuterones intercambiables, donde tal transformación ocurre en presencia de una fuente de deuterio adecuada, sin ningún catalizador. El uso de catalizadores ácidos, básicos o metálicos, junto con condiciones de temperatura y presión aumentadas, puede facilitar el intercambio de átomos de hidrógeno no intercambiables, siempre que el sustrato sea resistente a las condiciones y reactivos empleados. Esto a menudo resulta en perdeuteración: intercambio de hidrógeno-deuterio de todos los átomos de hidrógeno no intercambiables en una molécula.
Un ejemplo de protones intercambiables que se examinan comúnmente de esta manera son los protones de las amidas en la columna vertebral de una proteína . [1] [2] [3] El método proporciona información sobre la accesibilidad al disolvente de varias partes de la molécula y, por tanto, la estructura terciaria de la proteína. El marco teórico para comprender el intercambio de hidrógeno en proteínas fue descrito por primera vez por Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang y fue el primero en aplicar el intercambio H / D para estudiar proteínas. [4]
Reacción de intercambio
En solución prótica, los protones intercambiables, como los del grupo hidroxilo o amina, intercambian protones con el disolvente . Si el D 2 O es disolvente, se incorporarán deuterones en estas posiciones. La reacción de intercambio se puede seguir usando una variedad de métodos (ver Detección). Dado que este intercambio es una reacción de equilibrio, la cantidad molar de deuterio debería ser alta en comparación con los protones intercambiables del sustrato. Por ejemplo, se agrega deuterio a una proteína en H 2 O diluyendo la solución de H 2 O con D 2 O (por ejemplo, diez veces). Por lo general, el intercambio se realiza a pH fisiológico (7,0 a 8,0) donde las proteínas se encuentran en su conjunto más nativo de estados conformacionales. [5] [6]
La reacción de intercambio H / D también puede ser catalizada por catalizadores ácidos, básicos o metálicos como el platino. Para los átomos de hidrógeno de amida de la cadena principal de las proteínas, la tasa de intercambio mínima se produce a aproximadamente pH 2,6, en promedio. Al realizar el intercambio a pH neutro y luego cambiar rápidamente el pH, las tasas de intercambio de los hidrógenos de amida de la cadena principal pueden ralentizarse o apagarse drásticamente . El pH al que se apaga la reacción depende del método de análisis. Para la detección por RMN, el pH se puede mover a alrededor de 4.0 a 4.5. Para la detección por espectrometría de masas, el pH se reduce al mínimo de la curva de intercambio, pH 2,6. En el experimento más básico, se deja que la reacción tenga lugar durante un tiempo establecido antes de que se apague.
El patrón de deuteración de una molécula que ha sufrido intercambio H / D puede mantenerse en ambientes apróticos. Sin embargo, algunos métodos de análisis de deuteración para moléculas como las proteínas se realizan en solución acuosa, lo que significa que el intercambio continuará a un ritmo lento incluso después de que se apague la reacción. El intercambio indeseado de deuterio-hidrógeno se denomina intercambio inverso y se han ideado varios métodos para corregirlo.
Detección
El intercambio H – D fue medido originalmente por el padre del intercambio de hidrógeno, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, utilizando tubos de gradiente de densidad. En los tiempos modernos, el intercambio de HD se ha supervisado principalmente mediante los métodos: espectroscopia de RMN , espectrometría de masas y cristalografía de neutrones . Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes.
Espectroscopia de RMN
Los núcleos de hidrógeno y deuterio son muy diferentes en sus propiedades magnéticas. Por tanto, es posible distinguir entre ellos mediante espectroscopia de RMN . Los deuterones no se observarán en un espectro de 1 H NMR y, a la inversa, los protones no se observarán en un espectro de 2 H NMR. Cuando se observan pequeñas señales en un espectro de RMN de 1 H de una muestra muy deuterada, estas se denominan señales residuales. Se pueden utilizar para calcular el nivel de deuteración en una molécula. Señales análogas no se observan en 2 H espectros de RMN debido a la baja sensibilidad de esta técnica en comparación con el 1 análisis H. Los deuterones suelen exhibir cambios químicos muy similares a sus protones análogos. Análisis a través de 13 espectroscopía de RMN de C también es posible: los diferentes valores de spin de hidrógeno ( 1 / 2 ) y deuterio (1) da lugar a diferentes multiplicidades de división. La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la deuteración de moléculas específica del sitio.
Otro método utiliza espectros HSQC. Normalmente, los espectros de HSQC se registran en una serie de puntos de tiempo mientras el hidrógeno se intercambia con el deuterio. Dado que el experimento HSQC es específico para el hidrógeno, la señal decaerá exponencialmente a medida que el hidrógeno se intercambie. Entonces es posible ajustar una función exponencial a los datos y obtener la constante de intercambio. Este método proporciona información específica de residuos para todos los residuos en la proteína simultáneamente [7] [8] El mayor inconveniente es que requiere una asignación previa del espectro para la proteína en cuestión. Esto puede ser muy laborioso y, por lo general, limita el método a proteínas de menos de 25 kDa . Debido a que se necesitan de minutos a horas para registrar un espectro de HSQC, las amidas que se intercambian rápidamente deben medirse utilizando otras secuencias de pulsos.
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio puede determinar el contenido total de deuterio de las moléculas que han sufrido intercambio H / D. Debido a la preparación de la muestra requerida, normalmente se considera que solo proporciona una medición precisa de átomos de hidrógeno no intercambiables. También puede implicar el intercambio de H / D en la fase gaseosa [9] o el intercambio de la fase de solución antes de la ionización. [3] Tiene varias ventajas en la espectroscopia de RMN con respecto al análisis de las reacciones de intercambio H – D: se necesita mucho menos material, la concentración de la muestra puede ser muy baja (tan baja como 0,1 uM), el límite de tamaño es mucho mayor, y los datos generalmente se pueden recopilar e interpretar mucho más rápidamente. [10]
El núcleo de deuterio es dos veces más pesado que el núcleo de hidrógeno porque contiene tanto un neutrón como un protón. Por tanto, una molécula que contenga algo de deuterio será más pesada que una que contenga todo hidrógeno. A medida que una proteína se deutera cada vez más, la masa molecular aumenta en consecuencia. La detección del cambio en la masa de una proteína tras la deuteración fue posible gracias a la espectrometría de masas de proteínas moderna, informada por primera vez en 1991 por Katta y Chait. [11]
Determinar la deuteración específica del sitio mediante espectrometría de masas es más complicado que usar espectroscopía de RMN. Por ejemplo, la ubicación y la cantidad relativa de intercambio de deuterio a lo largo de la estructura del péptido pueden determinarse de forma aproximada sometiendo la proteína a proteólisis después de que se haya apagado la reacción de intercambio. A continuación, se analizan los péptidos individuales para determinar la deuteración global de cada fragmento de péptido. Usando esta técnica, la resolución del intercambio de deuterio está determinada por el tamaño de los péptidos producidos durante la digestión. [12] La pepsina , una proteasa ácida , se usa comúnmente para la proteólisis, ya que el pH de apagado debe mantenerse durante la reacción proteolítica. Para minimizar el intercambio inverso, la proteólisis y el posterior análisis de espectrometría de masas deben realizarse lo más rápido posible. La separación por HPLC del digerido péptico a menudo se lleva a cabo a baja temperatura justo antes de la espectrometría de masas por electropulverización para minimizar el intercambio inverso. Más recientemente, se ha utilizado UPLC debido a sus capacidades superiores de separación. [13]
En 1999 se propuso que podría ser posible lograr la resolución de un solo residuo mediante el uso de la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID) de péptidos deuterados junto con espectrometría de masas en tándem . Pronto se descubrió que la CID provoca una "alteración" de la posición del deuterio dentro de los péptidos. [14] [15] Sin embargo, la fragmentación producida por la desintegración en fuente (ISD) de MALDI , la disociación por captura de electrones (ECD) y la disociación por transferencia de electrones (ETD) proceden con poca o ninguna codificación en las condiciones experimentales correctas. [16] [17] [18] La alteración del etiquetado isotópico es causada por el calentamiento por colisión antes de la disociación del ión y, aunque el CID causa alteración, el calentamiento por colisión también puede ocurrir durante la ionización y el transporte de iones. [19] Sin embargo, mediante la optimización cuidadosa de los parámetros del instrumento que causan el calentamiento de iones, la codificación de hidrógeno se puede minimizar hasta un grado que preserva el marcado isotópico de la fase de solución hasta que se pueda realizar la fragmentación utilizando una técnica en la que no se produzca codificación. [17] [18] [20] [21] Más recientemente, la fotodisociación ultravioleta (UVPD) también se ha investigado como una posible técnica de fragmentación para localizar el deuterio dentro de péptidos y proteínas. [22] [23] En este sentido, las conclusiones se han mezclado, mientras que es posible obtener fragmentos de UVPD que no se han sometido a codificación en determinadas condiciones, otros han demostrado que la codificación puede ocurrir tanto para péptidos como para proteínas durante el paso de fragmentación de UVPD. sí mismo. [22] [23] La teoría que consolida estas aparentes contradicciones tiene que ver con la vía de doble fragmentación que puede surgir de la irradiación UV de péptidos y proteínas, es decir, la disociación directa y estadística. [24] Es decir, si las condiciones experimentales favorecen la disociación directa y el ión precursor se mantiene a bajas energías internas antes y durante la fragmentación, el nivel de deuterio de los fragmentos resultantes corresponderá al precursor no revuelto. [22] Sin embargo, las condiciones experimentales pueden favorecer la disociación estadística durante la irradiación ultravioleta, especialmente en tiempos de irradiación prolongados y baja presión de gas, lo que conduce a la conversión interna de la energía de excitación electrónica aportada por los fotones ultravioleta. [23] El resultado es la excitación vibratoria de la molécula irradiada que, a su vez, sufre una mezcla.
Cristalografía de neutrones
El intercambio de hidrógeno-deuterio de especies de intercambio rápido (por ejemplo, grupos hidroxilo) puede medirse cuantitativamente con resolución atómica mediante cristalografía de neutrones y en tiempo real si el intercambio se realiza durante el experimento de difracción.
Los haces de neutrones de alta intensidad se generan generalmente por espalación en aceleradores de partículas de linac como la fuente de neutrones por espalación . Los neutrones difractan los cristales de manera similar a los rayos X y pueden usarse para la determinación estructural. Los átomos de hidrógeno, con entre uno y cero electrones en un entorno biológico, difractan los rayos X de manera deficiente y son efectivamente invisibles en condiciones experimentales normales. Los neutrones se dispersan desde los núcleos atómicos y, por lo tanto, son capaces de detectar átomos de hidrógeno y deuterio.
Los átomos de hidrógeno se reemplazan habitualmente con deuterio, que introduce un factor de dispersión fuerte y positivo. A menudo es suficiente reemplazar solo el solvente y los átomos de hidrógeno lábiles en un cristal de proteína por difusión de vapor. En tal estructura, la ocupación de un átomo de deuterio intercambiable en un cristal se refinará de 0 a 100%, cuantificando directamente la cantidad de intercambio.
Aplicaciones
Dispersión de neutrones
La perdeuteración de un componente de un sistema multicomponente puede proporcionar contraste para experimentos de dispersión de neutrones , donde el contraste obtenido mediante el uso de disolventes deuterados es insuficiente. [ cita requerida ]
Estructura proteica
No es posible determinar la estructura de una proteína con intercambio H / D que no sea la cristalografía de neutrones ni es posible definir elementos estructurales secundarios. Las razones de esto están relacionadas con la forma en que la estructura de la proteína ralentiza el intercambio. Los tipos de cambio son una función de dos parámetros: accesibilidad a los disolventes y enlaces de hidrógeno. Por tanto, una amida que forma parte de un enlace de hidrógeno intramolecular se intercambiará lentamente, si es que lo hace, mientras que una amida en la superficie de la proteína unida al hidrógeno se intercambiará rápidamente. Las amidas enterradas en el disolvente pero sin enlaces de hidrógeno también pueden tener tasas de cambio muy lentas. Dado que tanto la accesibilidad a los disolventes como los enlaces de hidrógeno contribuyen a la tasa de intercambio, resulta difícil atribuir una tasa de cambio determinada a un elemento estructural sin cristalografía o datos estructurales de RMN.
El intercambio H – D se ha utilizado para caracterizar la vía de plegamiento de las proteínas, al replegar la proteína en condiciones de intercambio. En un experimento de intercambio directo (H a D), se agrega un pulso de deuterio después de varias cantidades de tiempo de replegamiento. Las partes de la estructura que se forman rápidamente estarán protegidas y, por lo tanto, no se intercambiarán, mientras que las áreas que se pliegan tarde en la vía estarán expuestas al intercambio durante períodos de tiempo más largos. Por tanto, el intercambio H / D se puede utilizar para determinar la secuencia de varios eventos de plegado. Los factores que determinan la resolución temporal de este enfoque son la eficiencia de la mezcla y la rapidez con la que se puede realizar el enfriamiento después del etiquetado.
El intercambio H – D se ha utilizado para caracterizar las estructuras de las proteínas [25] y las interacciones proteína-proteína. [26] La reacción de intercambio debe realizarse con las proteínas aisladas y con el complejo. A continuación, se comparan las regiones de intercambio. Si una región está enterrada por la unión, las amidas de esta región pueden protegerse en el complejo e intercambiarse lentamente. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el intercambio H-D no se puede utilizar para localizar interfaces de unión para todas las interacciones proteína-proteína. Algunas interacciones proteína-proteína son impulsadas por fuerzas electrostáticas de cadenas laterales y es poco probable que cambien la tasa de intercambio de los hidrógenos amídicos de la cadena principal, particularmente si los hidrógenos amídicos se encuentran en elementos estructurales estables como las hélices alfa .
Por último, el intercambio de HD se puede utilizar para controlar los cambios conformacionales en las proteínas en relación con la función de las proteínas. Si la conformación se altera como resultado de una modificación postraduccional , activación enzimática, unión al fármaco u otros eventos funcionales, es probable que se pueda detectar un cambio en el intercambio H / D. [27]
HDXsite (un servidor web en línea)
HDXsite es un servidor web en línea que incluye algunas aplicaciones como el modelador HDX que aumenta la resolución de datos HDX experimentales y factores de protección de modelado para residuos individuales. [28] [29] ( https://hdxsite.nms.kcl.ac.uk/ )
Referencias
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